研究課題
挑戦的萌芽研究
本申請ではHBV pseudotypeの作製に成功し、感染性を指標にした新たなアッセイ系を用いてウイルス学上の最大の難問に挑んだ。I) HBV pseudotype(HBV膜粒子を被ったgfp遺伝子を含むレトロウイルスゲノムをもつpseudotypeウイルス; HBV-p)の作製に向けたパッケージング細胞とHBVp産生系の確立.a)パッケージング細胞の樹立.レトロウイルスゲノム産生ベクター(HyTc-gfp)及びgag-pol発現ベクター(gp)を培養細胞株へトランスフェクションしgfp及びハイグロマイシン耐性遺伝子(hygR)をもつレトロウイルスゲノムを産生するパッケージング細胞を樹立した。b)パッケージング細胞の活性の検討. a)で作製したパッケージング細胞でVSV-G pseudotypeの作製を試みパッケージング細胞として活性をもつかどうかを検討した-すなわち、本細胞へVSV-G発現ベクターをトランスフェクションし、培養上清中に出現したVSV-G pseudotypeを全く別の培養細胞株への感染性を検討した。c) H BV-p産生能の検討.本パッケージング細胞へHBV粒子膜蛋白遺伝子発現ベクターをトランスフェクションし、分泌されるウイルス粒子をPEG沈殿法、超遠心法、抗HBs抗体を用いた免疫沈降法などで回収し、粒子内ゲノム(RNA)を抽出する。RT-PCR法による粒子内ゲノムgfpを標的としたRT-PCR法で検討した。d) HBV-p産生効率の検討. GFP産生を指標にトランスフェクション効率を評価し、トランスフェクションの最適化を図りつつ、産生量を定量PCR法で検討した。II) HBV-pを用いた感染性を指標にしたHBV感染受容体のスクリーニング.レトロウイルスcDNAライブラリーをHBV-pにより、スクリーニングしたが、結果的にはまだ感染受容体の候補因子は見つかっていない。しかしながら、本実験過程で、肝癌由来培養細胞株に非活性型の受容体の存在が示唆される結果を得た。
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