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本研究課題は、独自の熱制御機構を持つ超高速リアルタイムPCR機を使い、全行程が30分以内に終了するポータブルな高病原性トリインフルエンザ迅速遺伝子診断法の開発を目的とし、本年度は以下について、検討を行った。
1.反応試薬・条件の検討:通常のPCRと熱制御方式の違いから、酵素、条件検討が必要である。
高速性を謳っている市販のTaqポリメラーゼ(3社9種類)の検討を行ったところ、2社3種類のポリメラーゼのみ、使用可能であった。このうち、上市、特許などの観点から、1種類に絞り、至適条件を決定した。
2.RNA抽出法の確定:全行程を30分以内に設定した場合、RNA抽出は10分以内に終える必要がある。
約30分を要する市販のウイルスRNA抽出キットの各ステップについて、省略可能なステップを検討し、8分に短縮した。最終的に抽出から検出まで30分以内、計28分で終了できる系を構築した。
3.病院検体を用いた検討:実サンプル(咽頭もしくは鼻腔ぬぐい液)にはRNase、細胞、粘液などが含まれ、RT-PCRの挙動は、PCRの阻害、バックグラウンドも含め、モデル系と大きく異なることが予想される。
本年度は、イムノクロマト法でインフルエンザと判定された臨床検体を用いて検討した。イムノクロマト法に用いた検体の残りからRNAを抽出し、同PCRにて検討を行った。通常のリアルタイムPCRと比べ、若干の特異性の低下がみられたが、季節性ソ連型、タミフル耐性、季節性香港型を区別できることが示唆された。
通常のリアルタイムPCRを用いた確定診断には2時間以上かかるが、本PCRを用いることで、実検体を用いてもRNA抽出から測定終了まで、30分以内に終了したことは、本法で実用化を目指す意義は大きいと考えられた。
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