| 研究概要 |
1)ビタミンB12結合蛋白質融合AQP5蛋白質発現用のプラスミドベクターのラット唾液腺の導管へのトランスフェクション－AQP5cDNAをビタミンB12結合蛋白質発現用ベクターに挿入し、ウィスター系雄ラット(8週齢)の耳下腺へトランスフェクションした。
2)ポルフィリン環蛍光によるAQP5の局在・動態の可視化-３～５日間飼育したラットの耳下腺を摘出、遊離細胞を調製し、培養溶液のカルシゥム濃度を変えるか、種々のアゴニストを加えて刺激しポルフィリン環 蛍光を測定した。また、セビメリンを投与後、経時的に耳下腺を摘出して凍結切片を作成、包埋し、共焦点顕微鏡で観察した。
3)ポルフィリン環蛍光の種々の実験操作による安定性の検討-①非イオン性界面活性剤抵抗性実験による解析-ビタミンB12結合蛋白質融合AQP5蛋白質のベクターをラット唾液腺の導管へのトランスフェクションしたラット及び対照ラットの尾静脈へセビメリンを投与し､経時的に耳下腺を摘出してホモジネ－トを調製した。3,000ｘｇで10分間遠心して核と細胞残渣を除去した後、上清を100,000ｘｇで 60分間遠心して沈渣を得た。この沈渣を１%Triton X (TX)-100を含むTNE溶液で氷冷下にて30分間可溶化した後、遠心して可溶性画分(ラフト)と不溶性画分を得た。これらの画分をSDS－PAGEに供し蛍光を解析したところ、定常置に認められた。②浮遊実験による解析-耳下腺･顎下腺の片ホモジネ－トをTX-100及び種々の蛋白質分解酵素阻害薬を含むTNE溶液で可溶化した標品のはOptiPrep40%に調製して遠心チュ－ブの底に置き、その上に各種まぅどのOptiPrepを積層し240,000ｘｇで18時間遠心し、各画分の蛋白質をメタノ－ル/クロロフォルムで沈渣として回収し、SDS－PAGEに供し蛍光を解析したところ、定常置に認められた。
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