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１）TRP電流とDAGの測定による定量的解析： 生理的条件下におけるTRP電流とジアシルグリセロール（DAG）の同時測定を実施した。DAGを測定するため、カルシウム非感受性ProteinKinaseC(PKC)epsilonプローブ(蛍光共鳴エネルギー移動を原理とする）を用いた。ムスカリン性作動薬カルバコールやバソプレッシンをTRPC6/7チャネルが発現している細胞に作用させ、TRPC6/7電流とDAG増加量を同時に計測した。カルバコール刺激の強さを様々に変えるなどしてデータを取得、その後電流とDAGの相関性を検討した。論文投稿後、TRPCチャネルのPKC変異体を作成するなどして補足実験を行った。
２）PIP2-DAGシグナルと連動したTRPC電流のモデル化の精密化： イノシトール代謝系のモデルと、これに連動したTRPCチャネルのモデルを構築し全体像を明らかにする必要があった。昨年、コンピュータモデルを自作したが、計算に時間がかかるなどの問題があった。そこでシミュレーションに適したソフトに同様のモデルを移植を試みた。しかしながら、シミュレーションソフトの使い方を習得するのに時間がかかったため、計画より進まなかった。今後、個別に対応する予定である。
３）細胞内カルシウムとの関連性： TRPC3/6/7チャネル自身の活性化は、細胞内にカルシウムを動員する。この為ホスホイノシチドによる制御が細胞内カルシウムによって変化するか、検討する必要性があった。そこで、１）細胞内外のカルシウム濃度を変化させ、その時のTRPC6/7電流のkinetics解析を行った。２）実際に細胞内カルシウムがどの程度変化したのか、カルシウムプローブを用い電流との同時測定を行った。 これらの実験から、今後の研究へ発展する上で、重要な足掛かりとなる知見が得られた。
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