研究課題
本研究課題は、経シナプス順行性・逆行性トレーサータンパクを発現するレンチウイルスを開発・利用し、視床皮質神経回路におけるシナプス結合特性を単一神経細胞レベルで解析することを目的とするものである。本年度は、(1)経シナプストレーサータンパク(WGAもしくはGFP-TTC)とマーカータンパク(GFPもしくはRFP)を共発現するレンチウイルスベクターの開発・検討、(2)経シナプストレーサータンパク検出系の最適化を行った。(1)共発現型レンチウイルスの開発:Tet-Offシステムを用い、2種の遺伝子を効率的に共発現するレンチウイルスの開発・検討を、成体ラット線条体にて行った。Tet応答性双方向性プロモーター(TREB)下でGFPとRFPを発現させた場合、両者の発現量は感染細胞間でバラツキが非常に大きかった。脳心筋炎ウイルス由来のinternal ribosomal entry site (IRES)を用いた場合、発現量のバラツキは少なかったものの、IRES下流遺伝子の発現量が20分の1程度にまで低下した。手足口病由来の2Aシグナルを用いた場合、GFP・RFP共に強い発現を示した。よって現時点では2Aシグナルが共発現に最も適していると考えられる。(2)検出系の最適化:WGAもしくはGFP-TTCを単発現するレンチウイルスベクターを成体ラット脳内に注入し、WGAもしくはGFPに対する自作抗体を用い、検出方法の検討を行った。PAP法・TSA法・BAC法を組み合わせることで、免疫活性を検出することに成功したが、未だにシグナルが弱く、定量的解析を行えるレベルには達していない。引き続き、検出法を高める工夫が必要であると考えられる。
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すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 3件) 学会発表 (18件) 備考 (1件)
Cerebal Cortex
European Journal of Neuroscience
巻: 33(1) ページ: 95-109
The Journal of Comparative Neurology
巻: 518(15) ページ: 3149-3168
http://www.mbs.med.kyoto-u.ac.jp/
