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強力な摂食亢進ホルモンであるグレリンは、脂肪酸修飾という特徴的な構造を有している。グレリンの生理活性の発現にはこの修飾脂肪鎖が必須であり、かつN末端側の10アミノ酸残基が重要な役割を担っていることが示唆されている。その一方で、グレリンとグレリン受容体間の詳細な結合機序については未だ不明な点が多いため、本年度は、グレリンとグレリン受容体間の分子間ネットワークを包括的に推測するための評価系の構築に取り組んだ。
まず、ラットの胃から抽出したtotal RNAを鋳型として、7回膜貫通領域を持つ典型的なGPCRであるグレリン受容体(366アミノ酸残基)のcDNAをRT-PCR法にてクローニングした。得られたcDNAを基に、グレリンとの結合に必要とされる4つの細胞外領域部位(Loop 1; Met^1-Ala^<40>、Loop 2 ; Trp^<104>-Tyr^<128>、Loop 3 ; Glu^<188>-Ser^<207>、Loop 4 ; Phe^<289>-Cys^<304>)に対応するプライマーをデザインし、これを用いてPCR法にてLoop 1～4の各部位を増幅した。次いで、増幅DNA断片を発現ベクターに挿入し、Loop 1～4タンパク質を大腸菌内で過剰発現させた。発現タンパク質を精製後、SDS-PAGEにて精製度を確認した。
今後、Loop 1～4の4つのグレリン受容体細胞外領域部位をセンサーチップに固定し、グレリンとの分子間相互作用を表面プラズモン共鳴法により解析する。
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