| 研究概要 |
本年度は組換えヘルペスウイルスの作成を中心に以下のとおり実施した。
膵臓癌で過剰発現している複数のプロモーターマーカー配列の全長を正常膵臓DNAライブラリーよりクローニングした。その後、ルシフェラーゼ発現ベクター(pGL4 4.10, Promega)にサブクローニングした。プロモーター活性を調べるためpK1, pK8, pK59, Mia-PaCa2, KLMなどの膵臓癌細胞株に、前述のプラスミドDNAをトランスフェクションし、結果をもとに膵臓癌細胞における有効な最少プロモーター領域を決定した。活性を高めるため、膵臓癌細胞株においてのHPCコンストラクトのプロモーター活性の増強を図った。膵臓癌標的ハイブリッドプロモーター配列をFlip-Flop HSV-BACシステム(BMC Biotechnology 2006, 6 : 40)に。ICP4欠損変異株であるHSV1株d120全長をコードしたpM24-BACシャトルプラスミドと、d120株のICP4をコードしたpFLS-ICP4の二種類のベクターを用い、ルシフェラーゼアッセイの結果選んだHPCフラグメントを、pFLS-ICP4シャトルベクターにサブクローニングした。次にpM24-BACとpFLS-HPCをCre-LoxPサイトで相同組換させ、クロラムフェニコール/カナマイシン二重耐性クローンをラージスケールプレップで精製したのち制限酵素でフィンガープリントを行った。pM24-BAC-HPCコンストラクトを、ICP4遺伝子を恒常的に発現しているウイルスパッケージング細胞であるVero-E5細胞にFLPrecombinaseと共導入し組換えウイルスを得、大量培養系にて複製し、シングルクローンを得た。Vero細胞とVero-E5細胞を培養し、限界希釈法にてウイルス感染させ、ウイルスプラークが可視化されるまで培養した。その後、細胞をβ-galactosidaseで染色し、TCID50にてウイルス力価を算出し、ウイルス液を調製した。HSV1-ICP4タンパク質発現量を調べるため感染した細胞をLysateし、抽出したウイルスタンパク質をanti-HSV-ICP4 monoclonal antibody (US Biological, Swampscott, MA)を用いたウエスタンブロット法によって検出した。
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