| 研究概要 |
本年度はEGFに対するRNAアプタマーの取得、アプタマーのEGFへの親和性、特異性、EGFRリン酸化阻害の検討を研究目標とし、以下のとおり実施した。
1,ビオチンタグ化EGF蛋白質の作製。
EGFタンパク質をコードするcDNAをPinPointTM Xa-1 T-Vectorのクローニングサイトに挿入。大腸菌でビオチンタグ化EGF蛋白質を発現させた。これを精製しビオチンタグ化EGF蛋白質を取得した。
2,SELEX法
N50のランダム配列をもつ合成オリゴヌクレオチドをPCRにて増幅。T7 RNA増幅法を行い、この増幅RNAをEGF蛋白と結合させる。EGFに結合したRNAのみを回収。Reverse transcriptionにて1st strand DNAを合成し、次に2nd strand DNAを合成する。これを次の選別に使用する。この一連の淘汰、選別、増幅の操作を15 round繰り返すことによって、EGFに特異的に結合するRNA(抗EGFアプタマー)を取得する。現在、この手法を行っておりRNAの回収を行っている。
今後、以下の方法によって、アプタマーの選別、EGFRリン酸化阻害の検討を行う。
3.アプタマーの選別
(1)SELEX法にて得られたRNAのシークエンスを行い、共通配列の検索を行う。
(2)ゲルシフトアッセイにて、抗EGFアプタマーとEGFとの結合を確認する。
(3)リン酸化チロシンEGFR抗体を用いたウエスタンブロット法にて、アプタマーを加えたときのEGFRのリン酸化を定量。抗EGFアプタマーとEGFの結合によるEGFRのリン酸化阻害(シグナル伝達の阻害)を確認する。
(4)ゲルシフトアッセイにてEGFと親和性が高く、EGFRリン酸化を最も阻害する抗EGFアプタマーを選別する。
EGFに結合することによって、そのシグナル伝達を阻害するRNAアプタマーを取得する。新たな分子標的薬創製につなげていきたい。
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