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本研究では、転写伸長一時停止機構の分子機構の全容解明を目的とし、転写伸長一時停止機構に関与する分子(蛋白質・DNA・RNA)を、挿入的クロマチン免疫沈降法(insertional chromatin immunoprecipitation:iChIP)を用いて網羅的に同定・解析する。iCMP法を用いることで、生体内でのクロマチン構造を維持したまま転写伸長一時停止が行われているゲノム領域を単離し、解'析することができる。具体的には、c-fos遺伝子をモデルとし、(1)細菌のDNA結合蛋白であるLexAの結合配列を転写伸長一時停止部位近傍に相同組換えを用いて挿入し、(2)タグを付けたLexAのDNA結合ドメインを上記細胞へ発現させ、(3)坑タグ抗体を用いてクロマチン免疫沈降を行うことで、転写伸長一時停止領域を特異的に単離する。
昨年度に引き続き、c-fos遺伝子上の転写伸長一時停止部位近傍にLexA結合配列を挿入したニワトリDT40細胞株の作製を試みた。得られた細胞株において、LexA結合配列が挿入されたかどうか確認するためサザンプロットを行った結果、目的部位への挿入がみられなかった。現在、引き続き、細胞株を作製しているところである。一方、iChlP法で解析対象ゲノム領域に結合している蛋白質を同定する際の実験条件の最適化を行った。トランスジーンの系を用いて、解析対象ゲノム領域に結合する蛋白質の同定を試みた結果、当該ゲノム領域に結合する数種類の蛋白質を同定することに成功した。さらに、計算上、1x10^9個の細胞を用いることで、1コピーの解析対象ゲノム領域に結合する蛋白質の同定が可能であることも判明した。今後、相同組換えが確認できた細胞株を用いてiChIPを行い、c-fos遺伝子上の転写伸長一時停止部位近傍を単離し、結合している分子を解析する。
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