| 研究概要 |
本研究課題では、W/OエマルジョンPCRを利用したビーズディスプレイシステム用い、糸状菌由来の転写因子結合配列の大規模ライブラリースクリーニングを行い、糸状菌転写因子新規結合配列の獲得、改変プロモーターの創製を試み、バイオプロセス改変による有用物質の高効率生産への応用を目指す。
まず、糸状菌、Aspergillus nidulans由来転写因子AmyRを用いたスクリーニング系の確立を行った。塩基配列をN(A,T,GもしくはC)x22としたランダムDNAライブラリーを作製し、上記W/OエマルジョンPCRを用いてランダムDNAビーズライブラリーを調製した。転写因子AmyR溶液及び蛍光標識抗体をこのビーズライブラリーに加え、転写因子を介した蛍光複合体[ビーズ-結合DNA-転写因子-蛍光標識抗体]を形成させ、高い蛍光強度を保持するビーズ複合体をセルソーターを用いて回収する操作を計5ラウンド行った。その結果、5ラウンド後においてAmyR結合コンセンサス配列、CGGN8CGGが多数(109クローン中19クローン)確認された。現在、これら獲得クローンの評価を行っている。
また、酵母由来転写因子Gal4を用いて無細胞蛋白質合成系による転写因子結合部位スクリーニング系の確立を試み、ビーズ-Gal4結合DNA-in vitro発現Gal4-蛍光標識抗体の蛍光複合体形成に成功した。
さらに、このビーズディスプレイ法を用いたプロモーター活性選別法の開発を行い、T7プロモーター活性を指標としたスクリーニング系の確立に成功した。
今後、上記手法を組み合わせ、糸状菌ゲノムライブラリーもしくはランダムDNAライブラリーを用いた種々の転写因子結合配列のゲノムワイドスクリーニング、バイオプロセス改変による有用物質の高効率生産への応用を試みる。
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