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【平成22年度】Atg32相互作用因子の生化学的探索
まずはじめにAtg32精製のための発現系の構築とミトコンドリアの単離を試みた。マイトファジーに必須なタンパク質Atg32の精製用tag付きコンストラクト、Atg32-3xStrep-8xHisをAtg32欠損株において発現したところ、内在性のものと同等の機能を有することが確認された。また、大量培養条件におけるマイトファジー誘導条件下では、Atg32-3xStrep-8xHisが内在性のAtg32と同様に、一過的に発現のピークを迎えた後、すみやかに未知の分解メカニズムにより、自己分解されるという性質を伴うことが明らかとなり、タンパク質分解を阻害する精製条件下に加え、複合体として精製してくるためにさらなる工夫が必要であることが判った。
一方で、Atg32を生化学的アッセイにより解析した結果、Atg32はリン酸化を受けており、それに重要であると思われる部位を一部マッピングした。また、マイトファゴソーム膜形成時には、オートファジーの場合と同様にAtgタンパク質群がマイトファジーに機能していると思われるが、その中でもキナーゼ活性をもつAtg1がAtg32のリン酸化に直接、あるいは間接的に関与していることを示唆するデータを得た。これらの結果に加え、蛍光顕微鏡を用いた網羅的スクリーニングにおいて、ミトコンドリア・オートファジーに特異的な異常が認められた変異株が得られている。以上の結果を足がかりに、今後は生化学的手法に加え、遺伝学的手法からもAtg32相互作用因子の探索を展開してゆけることが期待される。
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