| 研究概要 |
低分子GTPアーゼを元にして試験管内で分子モーターへと進化させるために,まずタンパク質フィラメントである微小管との結合能を獲得する必要がある.初期配列として低分子GTPアーゼの一種でめるhrasとnras(ともにヒト由来)をクローニングし,大腸菌のコンポーネントを用いた無細胞試験管内転写・翻訳システムに依ってこれを発現することに成功した.また,その配列中の任意の箇所にランダムなアミノ酸配列を挿入するため,遺伝子配列中にNNK配列(Nはアデニン,グアニン,シトシン,チミン,Kはチミン,グアニン)を簡便に挿入するためのPCRベースの手法を開発した.挿入したランダム配列を翻訳したあとに,アミノ酸配列としてどのようなバリエーションが出現するかの検証を行った結果,ランダムアミノ酸配列としての品質を十分保っていることが分かった.GTPの加水分解とカップルした微小管結合能を獲得するためには,数多くの種類のランダム配列を挿入したrasタンパク質を選択サイクルに掛ける必要がある.そこで,従来のファージディスプレイ法よりも大きいライブラリサイズを期待できるリボソームディスプレイ法を用いて選択と変異導入を行うための予備実験を行った.リボソームディスプレイ法では選択したものと夾雑物のS/N比と,品質の高いmRNAを回収する過程が最重要であるため,得られたmRNAを高度に精製する方法の確立を行った.その結果,リボソームに提示させたmRNAが実際にRT-PCRによって回収・増幅できることが確認できた.選択サイクルを繰り返すまでには至らなかったが,各過程で検討が必要な部分が全て完了し,進化サイクルを回す準備が整った.
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