| 研究概要 |
イネのペルオキシソーム局在型BADHタンパク質はベタインアルデヒド（BA)を基質としにくく、むしろアセトアルデヒド（AA)を基質としやすいことに注目し、本年度は様々な植物のBADHタンパク質における、特にAAとBAに注目した基質特異性の解析、さらに基質特異性および親和性を決定するドメインの同定を目的とした。
１．様々な植物種のリコンビナントBADHタンパク質の作製。イネ、オオムギ、ヤンソウ、トウモロコシ、ソルガム、およびシロイヌナズナのＢＡＤＨ遺伝子をpET32aベクターに導入したコンストラクトを大腸菌BL21株に導入した。タンパク質発現誘導を行い、アフィニティクロマトグラフィ法によりそれぞれのリコンビナントBADHタンパク質を精製した。SDS-PAGEにより高度に精製されたことを確認し、主にAAとBAを中心にカイネティクス分析を行った。その結果、ほぼ全てのBADHタンパク質がBAを基質としたが、親和性はタンパク質により異なった。一方、AAについては、基質とするものとしないものに分けることができた。
２．２つのオオムギBADHタンパク質を用いたAAおよびBAに対する基質親和性の決定ドメインの解析。これまでの実験結果より、オオムギのBADHタンパク質（BBD1およびBBD2タンパク質）がそれぞれ、BAに対する基質親和性が約１０００倍異なり、さらにAAを基質とするものとしないものに分かれた。そこで、それぞれのタンパク質を４分割し、BBD1とBBD2の融合タンパク質をコードする遺伝子をPCR法により作製し、pET32aベクターに導入した。大腸菌BL21株に導入し、リコンビナントBBD1,2融合タンパク質を精製した。その結果、BAに対する基質親和性、およびAAに対する基質特異性いずれも、BBD1のカルボキシル基側４分の１の領域に決定するドメインが存在することが示唆された。
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