植物RNAウイルスのRNAサイレンシング抑制機構及びその制御機構

2010 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 22780035
• 研究機関: 東京大学
• 研究代表者: 竹田 篤史 東京大学, 大学院・総合文化研究科, 助教 (60560779)
• キーワード: サプレッサー / DCL1 / RNAサイレンシング / microRNA

研究概要

RCNMV感染におけるサイレンシング経路の役割を解析するために、dcl1-7、dcl2-1、dcl3-1、dcl4-2の一重から四重変異体、およびrdr1、rdr2、rdr6の一重から三重変異体を収集、栽培しウイルス接種実験に必要な量の種子を用意した。また、RCMV感染におけるDCL1の役割をより詳細に解析するために、これまで用いていたdcl1-9に加えて、dcl1-13とdcl1-100を収集した。これらの植物を用いて、次年度に順次接種実験を行う。RCNMV感染時のDCL1の局在を観察するために、赤色蛍光タンパク質の一つであるTagRFPをN末端に付加したTagRFP-DCL1コンストラクトを構築した。アグロインフィルトレーション法による局在観察の結果、DCL1が核内に局在する様子が観察された。一方、RCNMVの複製を緑色の蛍光で可視化するために、Bi-molecular complementation法を応用したコンストラクトを構築した。この系は、複製酵素成分の一つであるp27のC末端にGFPのN端側を付加したコンストラクト、ラムダファージのN22ペプチドとGFPのC末端側の融合コンストラクト、N22ペプチドが認識するステムループ構造を付加したRCNMVのRNA2を発現するコンストラクトから成る。完成したこれらコンストラクトを用いて、RNA複製中の複製酵素とウイルスRNAの局在を緑色蛍光として観察する計画である。TagRFP-DCL1との共接種を行いRCNMV感染時の複製酵素の局在とDCL1の局在を同時に追跡することを試みる計画である。また、サイレンシングサプレッサーの活性をより簡便に定量化するために、ルシフェラーゼを用いたアッセイ系を構築した。本系を用いる事でサプレッサーアッセイの効率化が可能となった。(767字)

研究成果

• [雑誌論文] Interactions between p27 and p88 replicase proteins of Red clover necrotic mosaic virus play an essential role in viral RNA replication and suppression of RNA silencing via the 480-kDa viral replicase complex assembly (2010)
  • 著者名/発表者名: Akira Mine, Kiwamu Hyodo, Atsushi Takeda, Masanori Kaido, Kazuyuki Mise and Tetsuro Okuno
  • 雑誌名: Virology 巻: 407 ページ: 213-224
  • 査読あり
• [雑誌論文] Unique functionality of 22-nt miRNAs in triggering RDR6-dependent siRNA biogenesis from target transcripts in Arabidopsis (2010)
  • 著者名/発表者名: Josh T. Cuperus, Alberto Carbonell, Noah Fahlgren, Hernan Garcia-Ruiz, Russel T. Burke, Atsushi Takeda, Christopher M. Sullivan, Sunny D. Gilbert, Taiowa A. Montgomery and James C. Carrington
  • 雑誌名: Nature Structural and Molecular Biology 巻: 17 ページ: 997-1004
  • 査読あり
• [雑誌論文] Identification and characterization of the 480 kilodalton template-specific RNA-dependent RNA polymerase complex of Red clover necrotic mosaic virus (2010)
  • 著者名/発表者名: Akira Mine, Atsushi Takeda, Takako Taniguchi, Hisaaki Taniguchi, Masanori Kaido, Kazuyuki Mise and Tetsuro Okuno
  • 雑誌名: Journal of Virology 巻: 84 ページ: 6070-6081
  • 査読あり
• [雑誌論文] Small RNA duplexes function as mobile silencing signals between plant cells (2010)
  • 著者名/発表者名: Patrice Dunoyer, Gregory Schott, Christophe Himber, Denise Meyer, Atsushi Takeda, James C. Carrington and Olivier Voinnet
  • 雑誌名: Science 巻: 328 ページ: 912-916
  • 査読あり
• [雑誌論文] 植物のmiRNA経路とsiRNA経路 (2010)
  • 著者名/発表者名: 竹田篤史
  • 雑誌名: 実験医学 巻: 28 ページ: 1573-1578