| 研究概要 |
Zinc finger nuclease(ZFNs)は標的配列に対し,正確に二本鎖切断を導入して相同組換えを誘導する,遺伝子ターゲッティング法に用いられる.すでに低頻度ながらone step disruptionの系が利用可能な糸状菌において,ヌクレアーゼやZFNsを用いた例はないことから,イネいもち病菌においてZFNs活性および相同組換え誘導とその促進条件について検討した.YFP遺伝子とブラストサイジン耐性遺伝子を融合したEYFP::BSD配列を元に,二本鎖切断により誘導された相同組換えを非破壊でモニターできるTG-RSマーカー系を導入したイネいもち病菌より,相同組換え検出系統の取得と高頻度相同組換え条件を確立した.特に本菌はストレス条件において,予想以上に相同組換え効率が高いことが明らかとなった.酵母ミトコンドリアDNAより得た低出現頻度の制限酵素I-sce 1遺伝子を糸状菌のコドン利用頻度に最適化して本菌へ導入したところ,高頻度の相同組換えが確認された.市販制限酵素や大腸菌から精製したI-Sce Iタンパク質を用いて,TG-RSマーカー株より作製したプロトプラストへ導入したところ,遺伝子によらない二本鎖切断により,相同組換えを誘導することに成功した.TG-RSマーカー配列をターゲットとしてZFNを構築するにあたり,DNA結合領域とFok Iヌクレアーゼ領域を糸状菌のコドン利用頻度に最適化して導入することで,出現するYFP蛍光コロニー数より相同組換え頻度を算出してその効果を評価し,ZFNsの最適条件を決定した.最終的にイネいもち病菌において,ZFNsを用いて二本鎖切断を導入する遺伝子ターゲッティング法が可能であることを示した.
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