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2010 年度 実績報告書

小胞体局在グルコシダーゼIIとその類縁酵素の基質認識機構の解明とその応用

研究課題

研究課題/領域番号 22780082
研究機関北海道大学

研究代表者

奥山 正幸  北海道大学, 大学院・農学研究院, 助教 (00344490)

キーワード小胞体グルコシダーゼ / タンパク質の分子進化 / 基質認識
研究概要

小胞体に局在し新生タンパク質の品質管理に重要なグルコシダーゼII,ならびにその類縁酵素の機能と構造の相関関係を明らかとすることを目的として研究を行った.
1.小胞体グルコシダーゼ モデル生物のひとつである分裂酵母Schizosaccharomyces pombeより同酵素の触媒サブユニットであるグルコシダーゼII α-サブユニットの遺伝子をPCRにより取得しクローニングした.本遺伝子を大腸菌発現用プラスミドベクターであるpET23dにサブクローニングし,大腸菌での組み換え酵素の生産を試みた.一般的なプロトコールでは組換えタンパク質は不溶性画分として生産された.そこで組み換え酵素生産条件の検討を行った.その結果,発現誘導物質であるIPTGを加えず,また低温度で培養することで可溶性画分に組み換え酵素を生産できた.組み換え酵素をNi-アフィニティークロマトグラフィーにより精製した.組み換え酵素はこれまで知られている類縁α-グルコシダーゼと異なり,合成基質であるp-nitrophenyl α-D-glucopyranosideを比較的よい基質と出来ることを明らかとした.また組み換え酵素は中性付近で最大反応速度を示すことを明らかとした.しかし,精製した組み換え酵素は不安定であり,安定なタンパク質を得るためにはヘテロダイマーを形成するβ-サブユニットが必要であることが示唆された.そこでβ-サブユニットとの共発現を行うために,β-サブユニットのcDNAを3'RACEと5'RACE法により取得した.
2.類縁酵素の異種宿主生産と機能解析 グルコシダーゼIIとアミノ酸配列類似性を示すタンパク質をコードする遺伝子を細菌よりクローニングし,大腸菌において,このタンパク質の生産を試みた.定法に従いタンパク質の生産し,Ni-アフィニティークロマトグラフィーにより精製した.このタンパク質はグルコシダーゼIIと明らかな配列類似性を示すにもかかわらず,α-グルコシダーゼ活性を有しておらず,新たな機能を有することが示唆された.

  • 研究成果

    (7件)

すべて 2011 2010

すべて 雑誌論文 (2件) (うち査読あり 2件) 学会発表 (5件)

  • [雑誌論文] Truncation of N- and C-terminal regions of Streptococcus mutans dextranase enhances catalytic activity2011

    • 著者名/発表者名
      Kim YM, et al
    • 雑誌名

      Appl.Microbiol.Biotechnol.

      巻: (掲載決定)

    • 査読あり
  • [雑誌論文] Suicide substrate-based inactivation of endodextranase by ω-epoxyalky1 α-D-gluco-pyranoside2010

    • 著者名/発表者名
      Kang HK, et al
    • 雑誌名

      J.Appl.Glycosci.

      巻: 57 ページ: 269-272

    • 査読あり
  • [学会発表] Improvement of production conditions of recombinant Podospora anserina α-glucosidase2011

    • 著者名/発表者名
      Song Kyung-Mo, 他
    • 学会等名
      日本農芸化学会平成23年度大会
    • 発表場所
      京都女子大(京都市)
    • 年月日
      2011-03-26
  • [学会発表] α-グリコシダーゼの機能と構造に関する研究2010

    • 著者名/発表者名
      奥山正幸
    • 学会等名
      若手研究者のための有機化学札幌セミナー
    • 発表場所
      北海道大学(札幌市)(招待講演)
    • 年月日
      2010-10-27
  • [学会発表] α-グリコシダーゼ機能と構造に関する研究2010

    • 著者名/発表者名
      奥山正幸
    • 学会等名
      日本農芸化学会東北支部・北海道支部合同支部大会
    • 発表場所
      東北大学(仙台市)(招待講演)
    • 年月日
      2010-09-27
  • [学会発表] Aspergillus niger α-glucosidaseのサブサイト+1の改変2010

    • 著者名/発表者名
      田上貴祥, 他
    • 学会等名
      日本応用糖質科学会平成22年度大会
    • 発表場所
      グランシップ静岡(静岡市)
    • 年月日
      2010-09-27
  • [学会発表] α-グリコシダーゼの機能と構造に関する研究2010

    • 著者名/発表者名
      奥山正幸
    • 学会等名
      日本農芸化学北海道支部大会
    • 発表場所
      北海道大学(札幌市)(招待講演)
    • 年月日
      2010-07-23

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公開日: 2012-07-19  

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