| 研究概要 |
シオミズツボワムシ(以下ワムシ)の全mtDNA塩基配列データおよび、GenBankに登録されている既知のワムシ由来のmtDNA遺伝子配列の相同解析を行い、ワムシの全mtDNAをPCRで増幅させるためのユニバーサルプライマーを設計した。
世界中から採集されたワムシのカルチャーコレクションより、形態種として従来法で分類されている3タイプのワムシを23株選択(L型10株、S型6株、SS型7株)した。これらのワムシ株を個別に培養し、それぞれ約60,000～80,000個体を収穫した。収穫したワムシをproteinase KとTE飽和フェノールを用いた方法により核酸を抽出し、RNase処理を行い、全DNAを精製した。これらの精製した全DNAは、アガロース電気泳動を行いDNAが崩壊していないことを確認し、さらに、吸光度法にてDNAの濃度を測定してからPCRの条件検討に使用した。
ユニバーサルプライマーと全DNAを用いて、mtDNAを増幅させるPCRの条件検討には、長鎖DNA増幅用、高増幅効率および、増幅時の正確性が高いDNAポリメラーゼをそれぞれ、2、3、2種類使用した。この結果、ワムシの全mtDNAを効率よくPCRで増幅させるには、高正確性を有する酵素の使用が最適であった。また、全mtDNA増幅させる際の反応液中に含まれるdNTPおよびユニバーサルプライマーは、通常使用される濃度よりそれぞれ2倍、1/2倍とすることで、さらに増幅効率を高められることを見出した。また、PCRのプログラムは、本酵素で通常用いられる2ステップ反応より3ステップ反応の方が、より安定的にワムシ全mtDNAが増幅可能であることを見出した。
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