|
各臓器や組織で発生する活性化学種に曝されている血中タンパク質は様々な修飾を受けていると考えられ、これらの解析が新たなバイオマーカー発見につながると期待される。しかし、こうした修飾は一般に特異性も低く、多様な修飾タンパク質を生成しうるため、その解析は容易ではない。そこで、従来のプロテオミクス手法を基盤に、新たに正負両イオンの相補的解析と各種修飾体を含む群特異的な標的タンパク質抽出法の導入を試み、血清アルブミン上の修飾プロファイリング法を検討した。
モデル修飾アルブミン調製のための酸化反応にはH_2O_2を用い、ニトロ化および糖化には、それぞれパーオキシナイトライトとグルコースを用いた。群特異的抽出には、固定化抗アルブミン抗体を利用した市販のアルブミン除去キットを使用した。修飾部位は、抽出物を常法に従い還元アルキル化後、トリプシンあるいはV8プロテアーゼで酵素消化し、MALDI/TOF-MSにより解析した。測定は、マトリクスに1%リン酸含有のDHBを用い、正イオン検出ならびに負イオン検出モードで行った。
まず、市販のヒト血清アルブミンを用い、2種のプロテアーゼならびに正負の各検出モードの結果を相補的に解析することにより、全アミノ酸配列をカバーするペプチド群の検出を可能にした。次いで、市販の正常ヒト血漿を各種反応に付した後、イムノアフィニティー抽出に付した後、上記手法により解析を行った。その結果、夾雑タンパク質に由来するピークは認められず、各反応後の試料において複数の修飾部位を同定可能であることを示した。これらの結果から、標的とするタンパク質上の非酵素的翻訳後修飾を網羅的に解析する上で本手法が有用であることを示した。
|
