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本年度は、バクテリオシンであるBreB、およびそのimmunity protein (自己耐性因子) であるBreEの標的分子の決定を目的として実験を進めた。
まず、far-western法による解析を試みた。BreBに対して感受性を示す菌株のうち、遺伝子操作の比較的行い易いLb. plantarum IFO 3070株を対象とし、構築したBreE発現シャトルベクターを導入し、BreE発現株 (BreB耐性) を作製した。BreE発現株および3070株 (非導入株) の膜タンパク質を抽出し、baitタンパク質としてBreBを、そして検出用の抗体として抗BreB抗体を用いて条件検討を重ねたが、相互作用すると考えられるタンパク質を検出することはできなかった。
続いて、抗体との共免疫沈降法により、溶液状態でBreBおよびBreEと相互作用するタンパク質を検出することを試みた。しかしながら、本方法によっても、特異的に作用するタンパク質を見出すことはできなかった。
そこで、blue native PAGE (BN-PAGE) と二次元電気泳動を組み合わせ、膜タンパク質抽出画分とBreBとの相互作用を解析することとした。その結果、BreE発現株では、BreBの添加によって特異的にシフトするバンドの存在が明らかになった一方で、3070株では、BreE発現株と同様に、BreBと相互作用するタンパク質の存在に起因すると考えられるBreBバンドのシフトが観察されるが、BreE導入株でみられたような特異的にシフトする他のバンドは観察されなかった。
本研究では、class IIbバクテリオシンの構成ペプチドであるBreBの標的タンパク質の存在と、immunity proteinであるBreEが存在する際、BreBと共に複合体を形成していると予想される膜タンパク質の存在を明らかにすることができた。
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