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一塩基多型(SNP)として261G/deletionおよび796C/Aを標的とし、鎖長およびプローブ内のSNPに対応するRNA塩基の位置が異なるDNA/RNAキメラプローブを作成した。これを合成した鋳型RNAと低温条件下でハイブリダイゼーションさせたのち、RNA分解酵素A(RNaseA)で処理することでSNP識別におけるRNA塩基の影響を詳細に検討した。最終生成物は蛍光検出器を備えたシークエンサーにて電気泳動することで、相対蛍光強度および生成物の大きさを明らかにした。反応に使用する鋳型、プローブおよびRNaseAの濃度を調整することで、RNaseAにより261G/deletion、796C/Aのいずれにおいても検出されるピークに基づいた型判定が可能であった。なお、DNA/RNAキメラプローブの鎖長は20塩基に比べて30塩基程度の長い場合に顕著に大きなシグナル強度が得られた。また、SNPを識別するRNA塩基は5'あるいは3'末端から数塩基の位置にある場合に比べて、プローブ中央付近に設定した場合でより明瞭にSNPを識別することができた。さらに2種類のプローブについて鎖長を変えることで両者を同時に型判定することが可能になった。RNaseAのミスマッチ認識能に基づいたSNPの識別はプローブの反応性および鋳型などの濃度が重要であり、多座位の同時判定には各領域の反応条件の至適化が必要であることが示唆された。
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