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平成22年度は、小型RFB(5ml容量)内に、可溶性アパタイトファイバーや多孔質セルロースビーズをスキャフォルドとして充填し、そこに不死化マウス肝細胞(IMH-4)、星細胞(A7)、内皮細胞(M1)、Kupffer細胞(K1)を共培養して、肝臓オルガノイドの作製を試みた。細胞は連携研究者の松浦らが、マウスから樹立した肝細胞(IMH-4) cell lineを、類洞内皮細胞はSV40 large T antigen geneを組み込んだトランスジェニックマウスより樹立した不死化細胞を用いた。今後、作製した肝臓オルガノイドを各種線維化マーカーで免疫染色し、星細胞活性化状態の比較検討を行っていく予定である。
また、3次元肝線維化モデルにおけるTGF-βと星細胞活性化について検討するための予備実験として、in vivoの新規の急性肝不全モデルであるTRECK (Toxin receptor-mediated cell knock out)肝炎モデルマウスを作製し、このモデルマウスの血中TGF-β断片(LAP断片)と肝組織LAP断片の発現を検討した。具体的には、肝臓特異的にヒトジフテリア毒素レセプターを発現したTRECKマウスにジフテリア毒素(DT)(Sigma)を500-1500ng/kgBW腹腔内に投与し、48時間後エーテル麻酔下で犠牲死させ、採血後、肝組織を採取し10%緩衝ホルマリンで固定し、分離血清で生化学一般検査、血漿でLAP-D濃度を測定した。肝組織では、Masson染色、渡銀染色および、組織に結合したLAP-Dを免疫染色し、比較検討した。今後、3次元肝線維化モデルにおけるTGF-β作用と星細胞活性化を検討していくうえで、in vivoモデルでのTGF-β作用と星細胞活性化を観察しておくことは有用であると考えられた。
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