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1)ヒト(Th17)/Th21細胞のクローニング
混合リンパ球培養反応(MLR)を用いた。MLRで誘導されるT細胞はTh1やTh2細胞が主体であり、それが産生するIFN_γやIL-2はTh17の分化や増殖を阻害してしまう可能性があることを考慮し、極小マイクロプレートを用いてMLRを限界希釈の状態で誘導。さらにこれにより得られた細胞クローンは、MLRに用いた抗原提示細胞と特定のサイトカイン(IL-23等)の存在下で継代維持することが可能であることをも見出した。Th17細胞クローンの樹立にはサイトカインとしてTGFβとIL-6を用いるが、Th21細胞クローンの樹立にはIL-6(50ng/ml)とIL-21(20ng/ml)を用いれば有効であることをすでに確認している。これを用いて複数のヒトTh21細胞クローンを樹立した。
2)ヒトTh17/Th21細胞のヘルパー機能の解明
Th17クローンを用いたトランスクリプトーム解析により、Th17はCXCL13を特異的に産生していることが明らかとなった。CXCL13は強力なB-cell chemoattractantであると同時にTh17が細胞外で増殖する病原微生物に対する生体防御に関わっている。活性化Th17とB細胞の共培養によって産生されるIgG subtypeをELISAで定量することによりこれを検証した。Th21についても同じようにB細胞の活性化や抗体が関連する自己免疫疾患への関与が推測されているため、同様の手法で解析した。
3)ヒトTh17/Th21細胞に特異的に発現する分子の解明
ヒト(Th17)/Th21細胞クローンからmRNAを抽出してcDNAを調整し、DNAチップを用いた網羅的トランスクリプトーム解析を行った。
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