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本研究では精嚢分泌タンパク質による精子膜構造の制御を介した精子運動・受精能獲得抑制機構について研究を行う。申請者はこれまでにSEMが精子の運動及び受精能獲得過程を抑制する作用を持つことを明らかにしているが、その受容分子機構についてはガングリオシドGM1の関与の他はほとんど明らかになっていない。特異的な受容体が存在する場合、その受容体が精子膜ラフト構造に関連して存在することが考えられるので受容体と相互作用する構成タンパク質を同定しシグナル伝達経路を明らかにする.一方、ヒト精子において受精能獲得前後でSEMGが精子膜ラフト構造の変化に影響を及ぼすことを確認しているのでSEMGの結合タンパク質と精子陣ラフト構造の関連について検討する。(1)膜ラフト構造への影響の検討:ヒト精子におけるSEMGによる膜ラフト構造への影響はこれまでの研究である程度明らかになってきているが、精子の洗浄法および固定法等に大きく影響を受けるので慎重に検計する必要がある.従って、本年度は改めて精子洗浄法による膜ラフト構造変化を検討した。具体的には、精子を採取し各種洗浄の後、受精能獲得のための培地中で培養する際に培地にSgを添加して先体反応及び精子運動超活性化と膜ラフト構造の変化を観察した。膜ラフト画分を定法に従って精製を試みたが、その後の他の研究の展開によりラフトマーカーの分布について異論があり、さらなる検討が必要となった。
(2)精子ミトコンドリアと運動性の関連検討:SEMGが精子中片部に結合している可能性は電子顕微鏡観査で明らかになってきているがシトコンドリア機能との関連については未だ検討されていない。ヒトでは特に精子集団がヘテロであり、集団として解析するとその差異が検出できない可能性が大きい。そこで研究計画では新しい試みとしてシングルセルPCR用のスライドチャンバーを用い、運動性を観察した上でSEMGとの結合性を確認し、さらにPCRによりミトコンドリアDNA量および欠失の有無を検出することで精子一細胞ごとにミトコンドリア機能と運動性の関連を検討することになっていたが、交付予定額が機材の購入必要額に溝たないため購入は断食せざるを得ない。そこで、本年度は96穴プレートにてシングルセルPCRを行う検討を行ったが、シングルセルで増幅できる条件は未だ検討中である。
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