| 研究概要 |
平成22年度研究期間の間には、動物内耳組織(ラット)で、マイクロアレイを用いたmiRNAの定量解析を行った。
生後0日、8日、20日のラットそれぞれ22耳、20耳、20耳から内耳組織を採取した。ラットからの組織採取は日本医科大学の動物実験倫理委員会の方針に則り、ペントバルビタールナトリウム30mg/kgの腹腔内注射による深麻酔下に断頭し内耳組織を摘出した。採取した組織はRNAlatorに浸けて保護し-80℃で凍結保存し、後日Agilent RNA6000ナノキットを用いてtotal RNAを抽出した。抽出濃度は、それぞれ377ng/ul、596ng/ul、164ng/ulであった。
抽出したtotal RNAをApplied Biosystems Megaplex RT Primers Rodent Pools A and Bを用いてTaqMan MicroRNA RT Kitで逆転写反応を行った。逆転写反応にはVeriti 200サーマルサイクラーを用いた。抽出したtotal RNA濃度が低い場合は、Megaplex PreAmp Primers Rodent Pools A and B及びTaqMan PreAmp Master Mix Kitを用いて前増幅を行う予定であったが、抽出したtotal RNAはすべて50ng/ul以上と十分に濃く前増幅は行わなかった。逆転写反産物はTaqMan^<[○!R]> Universal PCR Master Mix, No AmpErase^<[○!R]> UNG、TaqMan Rodent MicroRNA A and B Arrayを用いて、7900HT Fastを使用し、リアルタイムPCRを行った。それぞれの検体における発現量比の解析は、SDS2.3及びRQ managerを用いて、Mamm U6を内在性コントロールとして解析した。
今後は得られたデータをラットの日齢ごとに比較し、ラット内耳における加齢とmiRNAの関係を解析する。
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