研究概要 |
Rax(retina and anterior neural fold homeobox)promotor下にDsRed-neo casseteを挿入した。プラスミドを作成した。続いて相同組み換えを用いてBACクローンにrecombinant plasmidに導入した。同BACクローンをelectroporationを用いてmiPS細胞に導入した。(以後RxDsRed-miPSとする。)。RxDsRed-miPSをOsakada(Osakada F,Ikeda H,Sasai Y,Takahashi M.N at Protoc. 2009;4(6):811-24.)らの方法(serum free embryoid body+Dkk-1/LeftyA/FBS/activin)を用いて網膜前駆細胞へと分化誘導をおこなった。既報どおりにday9にて、蛍光の弱いものを含めればline20中、全lineでDsRed陽性細胞を検出することができた。続いて、FACSにてRxDsRed陽性細胞のsortを行った。sortによりRaxDsRed陽性細胞集団を得ることはできたが、蛍光補正をかけても、一般的にDsRed陽性とされる領域に検出できなかった。Mofloで行っても同様の結果であった。また比較的微弱な蛍光が検出されるとされているJSANでも同様の結果であった。 またNanog陽性細胞の割合が、80%近くを占めており未分化細胞の割合が多かったので、feeder細胞の抜き方を変更した。その結果、passageを繰り返してfeederを抜いたものでは、Nanog+細胞が少なかった。
|