| 研究概要 |
齲蝕予防を目的としたリプレイスメントセラピーに用いる多糖分解酵素産生菌をプラスミド由来発現（PLasmid-borne EXpression）（PLEX）系を利用して構築した。
PLEX系は、タンパク質の産生のために目的の遺伝子を適当なプラスミドベクターに挿入し、次いで、構築したプラスミドを用いてStreptococus gordoniiを形質転換し、目的の酵素を過剰発現・分泌する系である。まず、シャトルプラスミドpVA838から多糖分解酵素を合成及び分泌させるため、正の調節遺伝子rggとgtf-Gのプロモーター(P-gtf-G)及び分泌シグナル配列を利用し、その下流に多糖分解酵素遺伝子を組み込んだベクターを作製した。本年度は、はじめにPLEX系で多糖分解酵素分泌系を確立するために、ブルーデキストランを用いて活性が簡易に判定できるDextranase遺伝子を組込み、発現系の確立を目指した。850アミノ酸からなるDextranaseは、C末端領域にLPXTG配列を保有しているため、SortaseによるLPXTG配列の特異的切断を受け、生じたポリペプチド末端がペプチドグリカンにアミド結合することで、細胞壁に配置固定されるため、分泌されないと考えられた。そこで、Dextranase遺伝子のLPXTG配列(753-850アミノ酸)を除去し、rgg,P-gtf-Gの下流に組み込んだ(pVA838-rggDexA)。pVA838-rggDexAを用いてS. gordoniiを形質転換した。抗DexA抗体を用いたWestern blot法により、タンパク質の発現を確認し、ブルーデキストランSDS-PAGEにより分泌されたタンパク質の活性を確認した。
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