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チオレドキシン(Trx)は、ほぼ全ての生物が持ち、様々な代謝系の酵素の活性を調節する重要な蛋白質である。最近、私達は、ラン藻においてTrxが窒素固定酵素ニトロゲナーゼと相互作用するという興味深い結果を得た。しかし、ニトロゲナーゼは酸素高感受性であり、好気条件下では不可逆的に活性を失うため、生化学的解析が非常に難しい。そこで本研究では、嫌気実験系を用いたニトロゲナーゼの生化学的解析系を構築し、その活性制御機構の解明を行うことを目的とした。まずニトロゲナーゼの生化学実験の基盤を築くため、大腸菌において、ニトロゲナーゼを構成する2つの蛋白質、Fe-蛋白質とMoFe-蛋白質を活性型発現させる系の構築を試みた。各蛋白質にアフィニティータグを付加して発現させ、嫌気チャンバー内でタグを利用して精製した。MoFe-タンパク質は、微量にしか可溶化・精製できず、さらに、その吸収スペクトルから、金属中心を形成できていないことが示唆された。現在、精製条件の検討を進めると共に、金属中心の形成に関与する酵素群の発現を行い、金属中心のin vitro再構成を試みている。同時に、ラン藻においてMoFe-蛋白質を大量発現させる系の構築も進めている。一方、Fe-タンパク質は大腸菌において発現・精製することができ、その吸収スペクトルから、金属中心を保持していることが確認された。酵素活性を確認するためには、MoFe-蛋白質が必須であるため、活性型のMoFe-蛋白質を調製することが課題である。
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