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本申請課題では、任意の速度で励起光の偏光の向きを回転させることのできる顕微鏡を開発し、回転モーター蛋白質F1-ATPaseの構造変化と化学反応の観察に応用することを目標とした。今年度の成果は、この偏光変調全反射型顕微鏡に用いるステッピングモーターの回転速度を1Hzから10Hzに上げ、撮影にEMCCDカメラを用いることで、蛍光分子1個の向きの変化を角度分解能2°、時間分解能0.1秒で検出することに成功したことである。更に、この顕微鏡に磁気ピンセットを組み合わせる改良も加えた。電磁石を顕微鏡ステージ上に2対配置し、磁場により磁気ビーズの角度を任意に調整する。この磁気ピンセット付全反射型顕微鏡を用いて、1分子のF1-ATPaseの中心軸が回転中に起こる触媒サブユニットの構造変化を検出した。まず、ガラス基板上にF1-ATPaseを固定し、中心軸に磁気ビーズを結合した。次に、F1-ATPaseがATPの加水分解エネルギーを利用して自発回転する時と、磁気ピンセットの磁場に従ってATP合成方向に強制回転する時両方の触媒サブユニットの構造変化を比較した。その結果、ATP合成方向では加水分解方向の回転では見られなかった構造変化が検出された。この原因が基質の組成に由来するものなのか、回転方向の違いによるメカニズムの違いに由来するものなのかを現在検証中である。このように、偏光変調顕微鏡の時間分解能は発展途上であるが、現段階の中速の時間分解能でもF1-ATPaseの回転速度の方を抑えることで化学状態と構造状態を対応付ける道が開けた。また、高速偏光変調顕微鏡に使用する新しいモーターについても候補を増やして検討中であり、顕微鏡に組み込むための開発を進めている。
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