| 研究概要 |
加齢黄斑変性(Age-related Macular Degeneration, AMD)の発症と深く関与することが報告されているが、その詳細な役割が明らかにされていないARMS2(Age-Belated Maculopathy Susceptibility2)タンパク質の機能、およびAMDの発症メカニズム解明を行った。(1)ARMS2遺伝子はヒトを含む霊長類のみに存在し、その他の生物には存在しないことから、霊長類特有の細胞性質・機能にARMS2は関与していると推測される。そこでARMS2遺伝子をノックダウンしたヒト培養細胞を樹立し、細胞機能の変化を観察する。ARMS2遺伝子に対して8種類のshRNAをデザインし、発現ベクターにクローニングした。まず、これらコンストラクトとタグを付加したARMS2遺伝子をヒト培養細胞にco-transfectbnを行い、過剰発現の系でノックダウン効率をウエスタンブロッティング法で確認したところ、8種類のうち2つで有意なタンパク発現の減少が確認された。現在、このコンストラクトを培養細胞に遺伝導入し、薬剤によるスクリーニングにより、安定発現細胞株の樹立を行っている。(2)ARMS2を特異的に認識する抗体作製やGSTプルダウンアッセイなどを行うため、全長ARMS2タンパク質の大量発現を大腸菌にて試みた。しかし、ARMS2タンパク質は多くのレアコドンを含んでいるため、通常の方法にて発現を行うと多くの断片タンパク質の発現が認められた。そこで、それらレアコドンの置換を行うことで、全長ARMS2タンパク質を効率よく発現させることに成功した。今後、この精製タンパク質と分子生物学的手法を用いて機能解析を行う。
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