| 研究概要 |
1:神経系に特異的に発現しているSADキナーゼは神経細胞の極性形成に関与している。この上流因子としてはLKB1が知られているが、下流因子については不明な点が多い。我々は野生型マウス由来の神経細胞およびSADキナーゼノックアウトマウス由来の神経細胞に含まれるリン酸化タンパク質成分を二次元電気泳動にかけてその泳動パターンを比較し、質量分析を行った。今回、同定したアクチンフィラメントの制御因子であるSlingshot1について、SADキナーゼによるリン酸化部位を含むペプチドおよびGST融合タンパク質を合成し、大腸菌から精製したSADキナーゼと反応させることにより、Slingshot1がin vitroにおいてSADキナーゼの良い基質となることを明らかにした。この結果はSADキナーゼがSlingshot1の下流に位置するCofilinによるアクチンフィラメントの制御を介して神経細胞の極性化を引き起こしているという可能性を示唆している。Slingshot1に関してはリン酸化部位であるセリン残基のアラニン置換体およびアスパラギン酸置換体の作成を完了した。また、SADキナーゼノックアウトマウスにおけるSlingshot1のリン酸化状態を解析するために必要となる抗リン酸化部位抗体の作成を完了した。2:神経細胞の極性形成に関する時間的・空間的制御メカニズムを解明するためには分子活性のライブイメージングが必要不可欠である。我々はSADキナーゼのFRETプローブ作成を目指し、CFP,YFPをSADキナーゼの両端に接続した様々なコンストラクトを作成した。現在、蛍光強度およびFRET効率のスクリーニング中である。
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