外因性リガンド依存的Wntシグナル活性化による胃がん悪性化転移機構の研究

2023 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 22H00454
• 研究機関: 金沢大学
• 研究代表者: 大島 正伸 金沢大学, がん進展制御研究所, 教授 (40324610)
• 研究期間 (年度): 2022-04-01 – 2026-03-31
• キーワード: 胃がん / マウスモデル / オルガノイド / Wntシグナル / 転移

研究実績の概要

東アジアにおける胃がん罹患率は欧米に比較して高く、日本における転移胃がん患者の５年生存率は約6%と極めて低い。そのため、転移性を獲得した悪性胃がんに対する新規治療法開発は喫緊の課題であり、胃がん転移機構の解明を目指した研究は重要である。正常幹細胞の維持に重要なWntシグナルは、遺伝子変異により恒常的に活性化すると、消化管上皮細胞は腫瘍化する。しかし、胃がん細胞ではWntシグナル活性化を誘導するAPCやCTNNB1などの遺伝子変異頻度は低く、半数以上の患者由来胃がんオルガノイドでは、外因性WntリガンドによるWntシグナル活性化が、がん細胞増殖に関与することが報告された。以上の背景を基盤とし、本研究ではマウスモデルおよびオルガノイドを用いた個体レベルの研究により、外因性リガンド依存的なWntシグナルによる、転移をともなう胃がん悪性化機構を解明することを目的とする。そのため、Kras（K）、Tgfbr2（T）、Trp53（P）遺伝子変異と、Wntリガンド発現（W）を組み合わせた新規胃がんマウスモデル、およびオルガノイドを樹立し、それらを用いた組織学的解析により、胃がん悪性化機構を解析する。
これまでの研究により、KTPマウスでは胃粘膜上皮の異形成と限定的な腫瘍性病変が見られるのに対し、WKTPマウスでは浸潤性胃がんが発生し、リガンド依存的なWntシグナル活性化が原発巣胃がん発生に重要である事を明らかにした。さらに、KTPオルガノイドは転移性を獲得していないのに対して、WKTPオルガノイドは脾臓移植により肝転移巣を高頻度に形成することから、外因性WntリガンドによるWnt活性化は、転移巣形成にも重要な役割を果たすことが明らかとなった

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

Kras G12D変異（K）、Tgfbr2欠損（T）、Trp53 R270H変異（P）の３種類のドライバー遺伝子変異をさまざまな組み合わせで導入したマウスを作製した。これらのマウスと、胃粘膜上皮細胞でWntリガンド発現するK19-Wntマウスを交配し、各遺伝子変異マウス胃粘膜の病理解析により、以下の結果を得た。すなわち、KTP遺伝子変異マウスでは、胃粘膜上皮の粘液細胞化生と壁細胞の消失に加えて、軽度の異形成が見られたが、腫瘍性変化はほとんど見られなかった。一方でWntリガンド依存的にWntを活性化したWKTPマウスでは、胃粘膜で異形を伴う腫瘍細胞の増殖が認められ、粘膜下浸潤をともなう胃がんを発生した。
さらに、R5年度の研究により、KTPおよびWKTPマウス胃粘膜からオルガノイドを樹立し、それぞれマウス脾臓に移植して、肝転移巣形成について病理学的解析を行なった。その結果、KTPオルガノイドは肝臓類洞に到達しても生着せず、2週間後には腫瘍細胞が消失していたのに対して、WKTPオルガノイドは、肝臓類洞に到達後、線維化をともなう微小環境を形成して高頻度に転移巣を形成した。この結果により、外因性WntリガンドによるWnt活性化は、転移巣形成に重要な役割を果たすことが明らかとなった。そこで、内因性Wntシグナル活性化でも同様の転移巣形成効果が認められるか、検証するために、Apc遺伝子をCRISPR/Cas9で欠損させたKTP細胞（A-KTP細胞）を作製した。これまでに得られた予備的結果では、A-KTP細胞を脾臓に移植しても肝転移巣を形成しないことから、Wntリガンドによる間質細胞への作用が、転移巣形成に関与する可能性が考えられた。

今後の研究の推進方策

これまでの研究により、外因性Wntリガンド依存的なWntシグナル活性化は、ドライバー変異をともなう胃粘膜上皮細胞の異形成変化を誘導し、原発巣での浸潤性胃がん発生に重要な役割を果たすことを明らかにした。さらに、腫瘍細胞が血流を介して肝臓類洞に到達した後の、微小環境形成と転移巣形成にも重要であることが明らかとなった。転移巣形成に、腫瘍細胞自身の内因性Wnt活性化が必要かを検証するため、Apc遺伝子を欠損したA-KTPオルガノイドを樹立して検証実験を始めており、R6年度は継続してA-KTPによる転移巣形成能について、移植実験と病理学的解析により検証する。
さらに、これまでのA-KTP移植による予備的結果から、肝臓の間質細胞でのWnt活性化が重要である可能性が考えられたため、WntリガンドcDNAの発現ベクターをKTP細胞に導入し、新たにW-KTP細胞を構築する。そして、KTP細胞とW-KTP細胞をそれぞれマウスに脾臓移植し、肝転移巣形成について病理学的解析を実施する。KTPが転移しないのに対して、Wntリガンドを発現するW-KTPが転移能を獲得した場合、こ外因性Wntリガンドによる間質細胞でのWntシグナル活性化が、胃がん転移巣形成に必要である可能性が示唆され、A-KTP細胞が転移巣を形成しない結果とも一致する。以上は、本研究開始当初は予想していなかった、重要な発見となる。
以上の結果が得られた場合、転移巣間質で実際にWntシグナルが活性化しているのかについて、WKTP細胞の転移巣組織標本を用いた、空間トランスクリプトーム解析を実施して検証する。

研究成果

• [国際共同研究] IRCCS San Raffaele Scientific Institute(イタリア)
  • 国名: イタリア
  • 外国機関名: IRCCS San Raffaele Scientific Institute
• [雑誌論文] Gain-of-Function p53 Mutation Acts as a Genetic Switch for TGFβ Signaling Induced Epithelial-to-Mesenchymal Transition in Intestinal Tumors (2023)
  • 著者名/発表者名: Wang Dong、Nakayama Mizuho、Hong Chang Pyo、Oshima Hiroko、Oshima Masanobu
  • 雑誌名: Cancer Research 巻: 84 ページ: 56～68
  • DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-23-1490
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] Genetic and nongenetic mechanisms for colorectal cancer evolution (2023)
  • 著者名/発表者名: Kok Sau Yee、Nakayama Mizuho、Morita Atsuya、Oshima Hiroko、Oshima Masanobu
  • 雑誌名: Cancer Science 巻: 114 ページ: 3478～3486
  • DOI: 10.1111/cas.15891
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] In Vitro and In Vivo Models for Metastatic Intestinal Tumors Using Genotype-Defined Organoids (2023)
  • 著者名/発表者名: Morita Atsuya、Nakayama Mizuho、Oshima Hiroko、Oshima Masanobu
  • 雑誌名: Methods in Molecluar Biology 巻: 2691 ページ: 19～30
  • DOI: 10.1007/978-1-0716-3331-1_2
  • 査読あり
• [雑誌論文] In vivo macrophage engineering reshapes the tumor microenvironment leading to eradication of liver metastases (2023)
  • 著者名/発表者名: 1.Kerzel T, Giacca G, Beretta S, Bresesti C, Notaro M, Scotti GM, Balestrieri C, Canu T, Redegalli M, Pedica F, Genua M, Ostuni R, Kajaste-Rudnitski A, Oshima M, Tonon G, Merelli I, Aldrighetti L, Dellabona P, Coltella N, Doglioni C, Rancoita PMV, Sanvito F, Naldini L, Squdrito ML
  • 雑誌名: Cancer Cell 巻: 41 ページ: 1892～1910.e10
  • DOI: 10.1016/j.ccell.2023.09.014
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [学会発表] Genetically engineered tumor-derived organoid models to examine the metastasis mechanism of gastrointestinal cancer (2023)
  • 著者名/発表者名: Oshima H, Kok SY, Nakayama M, Ikeda Y, Matsunaga YT, Oshima M.
  • 学会等名: 41st Sapporo International Cancer Symposium
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Gain-of-function mutant p53 for activin signaling-induced epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) (2023)
  • 著者名/発表者名: Oshima M
  • 学会等名: 10th International MDM2 Workshop
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Identification of genotype-linked nano-scale physical properties of intestinal tumor cells (2023)
  • 著者名/発表者名: Oshima M
  • 学会等名: 7th WPI-NanoLSI International Symposium
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Organoid experiments to understand the metastasis mechanism (2023)
  • 著者名/発表者名: Oshima M
  • 学会等名: 5th National Cancer Center (NCC)-GCSP Inter-Academy Cancer Symposium
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Collective migration and polyclonal metastasis mechanism (2023)
  • 著者名/発表者名: Oshima M
  • 学会等名: Seoul International Gastric Cancer Forum 2023
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 腸管腫瘍の悪性化におけるKrasG12D変異の役割 (2023)
  • 著者名/発表者名: 大島正伸
  • 学会等名: 京都大学iCeMSシンポジウム，変異KRAS分子標的薬の開発と将来への展望
  • 招待講演
• [学会発表] Cancer evolution by positive and negative selection (2023)
  • 著者名/発表者名: Oshima M, Kok SY, Wang D, Nakayama M, Oshima H
  • 学会等名: 第20回幹細胞シンポジウム
  • 招待講演
• [学会発表] マウス胃がんオルガノイドによるWntリガンド依存的な悪性化機構の検討 (2023)
  • 著者名/発表者名: 大島浩子，古谷裕一郎，中山瑞穂，稲木紀幸，大島正伸
  • 学会等名: 第82回日本癌学会学術総会
  • 招待講演
• [学会発表] 消化器がん発生と悪性化進展を促進する炎症性微小環境 (2023)
  • 著者名/発表者名: 大島正伸
  • 学会等名: 第15回In vivo実験医学シンポジウム
  • 招待講演
• [図書] リンパ学 (2023)
  • 著者名/発表者名: 大島浩子，中山瑞穂，大島正伸
  • 総ページ数: 5
  • 出版者: 日本リンパ学会
• [図書] 別冊・医学のあゆみ「基盤病態としての慢性炎症」 (2023)
  • 著者名/発表者名: 大島浩子，中山瑞穂，大島正伸
  • 総ページ数: 6
  • 出版者: 医歯薬出版
• [備考] 金沢大学がん進展制御研究所 腫瘍遺伝学研究分野HP
  • URL: http://genetics.w3.kanazawa-u.ac.jp/