環状RNAの生合成を促進するアンチセンスオリゴの開発

2023 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 22K05315
• 研究機関: 東京医科歯科大学
• 研究代表者: 山田 剛史 東京医科歯科大学, 統合研究機構, 特任講師 (80633263)
• 研究期間 (年度): 2022-04-01 – 2025-03-31
• キーワード: 環状RNA / アンチセンス / バックスプライシング

研究実績の概要

本研究では、環状RNAの生合成機構であるバックスプライシングに着目し、新たに設計された合成オリゴヌクレオチド、CLIP-ONによって細胞内での環状RNA合成量を促進できるか調査した。バックスプライシングは、環状化するエキソンの上流と下流に位置するイントロンが相補鎖形成等によって架橋構造を形成し、上流のイントロンに存在するブランチポイントアデノシンと下流のイントロンの5’スプライシングサイトが近接することで促進される。CLIP-ONは、エクソンを挟む二つのイントロンと相補配列を有し、イントロン間の橋渡しを行うことでエキソンをまたいだヘアピン構造の形成を誘導し、環状RNA生合成を促進するトランス作用モデュレーターとして機能する。
HeLa細胞を使用したモデルpre-mRNAを用いて、CLIP-ONの投与によって標的の環状RNAが選択的に有意に増大することをRT-qPCRを用いて確認した。また、CLIP-ONの標的pre-mRNAとの結合をTm測定やITCを用いて確認し、環状RNA合成量がCLIP-ONのイントロン架橋能に依存していることが示された。
本研究は、細胞内の特定の環状RNAの表現を選択的に調節し、最終的には細胞機能を調節する新手法、CLIP-ONの設計と機能を初めて示した。しかしながら、本研究では特定の環状RNAおよび細胞モデルを対象としており、他の環状RNAや内在性環状RNAにおけるCLIP-ONの効果についてはさらに検討が必要である。CLIP-ONは、特定の環状RNAをターゲットとする新しい治療戦略の開発に貢献する可能性がある。また環状RNAの機能的研究や、疾患関連環状RNAの特定とその調節にも応用できる。本研究成果は研究期間中にScientific Reports誌にオープンアクセスで発表し、現在PCT申請を行っている。

現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

前年度は、RNA結合性低分子NCDを用いて環状RNA生合成促進のPOCをとり、査読論文を発表した。（Chem. Commun., 2022, 58, 3629-3632）本年度は、同様のコンセプトを異なるモダリティであるアンチセンスオリゴヌクレオチドで調査した。環状RNA(circZKSCAN1)を産生するモデルpre-mRNAを発現するプラスミドをトランスフェクトしたHeLa細胞を使用し、環状化エキソンの上流と下流に隣接するイントロンを水素結合によって架橋するオリゴヌクレオチド（CLIP-ON）をデザインした。CLIP-ONの細胞への投与によるcircZKSCAN1合成量の有意な増大をRT-qPCRを用いて確認した。架橋構造の形成はnative-PAGE、Tm、ITCおよびSPR実験で確認した。活性を示したアンチセンスの解離定数は10 nM程度で、CLIP-ONの結合強度と相関があることも確認した。本研究成果は今年度英語査読論文で発表した。(Sci. Rep., 2024, 14, 8096.)　昨年度に申請した本研究の国内特許は、今年度に学内審査を通過しPCT特許申請に拡張した。

今後の研究の推進方策

本研究のコンセプトである「アンチセンスオリゴを用いて環状RNAの生合成を促進する」ことをモデル細胞で証明し、査読論文を発表することができた。次のステップは、本コンセプトの内在性環状RNAへの適用である。これまでの実験結果より、CLIP-ONによる環状RNA合成量の増大は標的とするpre-mRNAの高次構造の安定性に大きく依存することが、in silicoにおける高次構造予測によってわかっている。薬学的に意義の高い標的環状RNAを調査し、それらの環状RNAを生産するpre-mRNAに対するCLIP-ONの結合効果を、バイオインフォマティクスを用いて予測する手法を開発する。また、CLIP-ONの核酸化学修飾により結合能の強化・鎖長の短縮化・生体内安定性・毒性軽減を目指し、実用的なアプリケーションを目指す。

次年度使用額が生じた理由

次年度使用額（B-A）が「0」より大きくなっているが、プロジェクトは予定より進んでいる。これは、プロジェクトの進行スケジュールの変更や予期せぬ遅延も見越した計画を立てたが、実際には予定通り・それ以上に実験計画が進行したからである。この助成金は、翌年度のプロジェクト活動の継続と拡大のために使用する予定である。具体的な使用計画として、さらにプロジェクトを発展させるための物品費に主に使用する。また、これまでの成果を積極的に発信していくため学会発表行うための旅費としてもこれを使用する。

研究成果

• [雑誌論文] A new small molecule DoNA binding to CAG repeat RNA (2024)
  • 著者名/発表者名: Chen Qingwen、Yamada Takeshi、Miyagawa Koichi、Murata Asako、Shoji Mitsuo、Nakatani Kazuhiko
  • 雑誌名: Bioorganic & Medicinal Chemistry 巻: 98 ページ: 117580～117580
  • DOI: 10.1016/j.bmc.2023.117580
  • 査読あり
• [雑誌論文] A machine learning approach toward generating the focused molecule library targeting CAG repeat DNA (2024)
  • 著者名/発表者名: Chen Qingwen、Yamada Takeshi、Murata Asako、Sugai Ayako、Matsushita Yasuyuki、Nakatani Kazuhiko
  • 雑誌名: Digital Discovery 巻: 3 ページ: 243～248
  • DOI: 10.1039/d3dd00160a
  • 査読あり
• [雑誌論文] Utility of oligonucleotide in upregulating circular RNA production in a cellular model (2024)
  • 著者名/発表者名: Ni Lu、Yamada Takeshi、Nakatani Kazuhiko
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 14 ページ: 8096
  • DOI: 10.21203/rs.3.rs-3849465/v1
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] NMR analysis of ¹⁵N-labeled naphthyridine carbamate dimer (NCD) to contiguous CGG/CGG units in DNA (2024)
  • 著者名/発表者名: Yamada Takeshi、Sakurabayashi Shuhei、Sugiura Noriaki、Haneoka Hitoshi、Nakatani Kazuhiko
  • 雑誌名: Chemical Communications 巻: 60 ページ: 3645～3648
  • DOI: 10.1039/d4cc00544a
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] リン酸骨格およびダイナミクスに着目したミスマッチDNA-低分子複合体のNMR解析 (2024)
  • 著者名/発表者名: 櫻林 修平, 古板 恭子, 杉浦 徳昭, 山田 剛史, 藤原 敏道, 中谷 和彦, 児嶋 長次郎
  • 学会等名: 日本化学会第104春季年会
• [学会発表] NMR determination of the binding mode of naphthyridine carbamate dimer (NCD) to CGG repeat DNA (2023)
  • 著者名/発表者名: Takeshi Yamada, Shuhei Sakurabayashi, Noriaki Sugiura, Kyoko Furuita, Chojiro Kojima, Kazuhiko Nakatani
  • 学会等名: International symposium on nucleic acid chemistry (ISNAC) 2023
  • 国際学会
• [学会発表] Predicting Molecular Interactions by Graph Convolutional Neural Networks with Global Features (2023)
  • 著者名/発表者名: Kaito Fukui, Qingwen Chen, Hiroaki Santo, Fumio Okura, Takeshi Yamada, Yasuyuki Matsushita, Kazuhiko Nakatani
  • 学会等名: International symposium on nucleic acid chemistry (ISNAC) 2023
  • 国際学会
• [学会発表] NMR determination of the binding mode of naphthyridine carbamate dimer (NCD) to CGG repeat DNA (2023)
  • 著者名/発表者名: 山田剛史
  • 学会等名: 核酸化学若手フォーラム2023
• [学会発表] Investigating new methods for up-regulating the production of circular RNA using cellular models (2023)
  • 著者名/発表者名: 山田 剛史, 倪 露, 中谷 和彦
  • 学会等名: 日本核酸医薬学会第８回年会
• [産業財産権] 一本鎖核酸およびその用途 (2024)
  • 発明者名: 山田剛史, Ni Lu, 中谷和彦
  • 権利者名: 大阪大学
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: PCT/JP2024/003377
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