| 研究課題/領域番号 |
22K05361
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
松山 晃久 国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 専任研究員 (90399444)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| キーワード | タンパク質ータンパク質間相互作用 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、生命現象の基盤となっているタンパク質－タンパク質間相互作用を解析するための方法として、近年注目されているNanoBiT発光補完法を分裂酵母の全遺伝子ライブラリーと組み合わせることで、タンパク質の相互作用相手を網羅的にスクリーニングする実験系を開発することを目指した。
このようなスクリーニング系において常に問題になるのは、タンパク質とタグとの位置関係により、タンパク質の機能あるいは相手タンパク質との相互作用の阻害が起こることである。そこで、タグ融合時における立体障害等の問題を可能な限り回避できるように、遺伝子をLgBiTと融合させる際にORFの5'末端にLgBiTを融合させるタイプの発現ベクターと、3'末端に融合させるタイプのベクターを別々に用意し、これらを同時に１つの株に発現できるようにした。しかし、本年度の解析の結果、このような染色体挿入型ベクターを用いてゲノムにGFPなどの蛍光タンパク質の遺伝子を挿入した際に得られる形質転換体の中には、非常に強い蛍光を発する細胞が生じることがわかった。これらの形質転換体は外来遺伝子が複数コピー導入されていることを示唆しているが、その出現頻度は数％程度と、通常の実験に用いるにはかなり不安が残る頻度と言える。現状、このような複数コピーの遺伝子が導入された形質転換体を排除する方法がないため、そのような形質転換体を誤って実験に用いてしまうのを回避する方法として、ベクターに蛍光タンパク質を別途発現するユニットを組み込み、形質転換体の蛍光強度を調べることにより、導入遺伝子が１コピーだけ染色体に組み込まれていることを確認できるシステムを構築した。これにより、コピー数の違いに起因するデータのばらつきが抑えられ、より定量的なデータが得られることが期待される。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
計画では、本年度に分裂酵母の全遺伝子をSmBiT発現ベクターにクローニングする予定であったが、スクリーニングする際に、より精度の高い安定したデータを得られるようにするために、発現ベクターのさらなる改良を行った。これにより、スクリーニングの開始自体は遅れることになるが、結果の解析と再現性の確認にかかる労力が軽減されることから、全体としては予定通りに研究が進むものと考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度開発した発現ベクターにより、染色体挿入の際に起こる導入遺伝子の多コピー化を防ぐことはできないが、多コピー化した形質転換体を簡単に見分けることができるようになった。そこで今後は本システムを取り入れたSmBiT発現用ベクターに分裂酵母の全遺伝子を組み込み、プレイ発現ライブラリーを作製する。
一方で、N末・C末にそれぞれLgBiTを融合させた２つのベイトを同時に発現させた場合に、それぞれ一方しか発現しない場合と比べてアドバンテージがあるかどうかを、相互作用が既知のタンパク質のペアを用いて検証する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
約5,000種類からなる分裂酵母の全遺伝子について、プレイ発現ベクターへのクローニングを計画していたが、スクリーニングをよりスムーズに行えるように、ベクターの改良を行ったため残額が生じた。これを次年度で行う大規模クローニングに使用する。
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