| 研究課題/領域番号 |
22K05362
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
河崎 史子 東京大学, 定量生命科学研究所, 助教 (40822911)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | シーケンシング / 修飾RNA塩基 |
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| 研究実績の概要 |
本研究の到達目標は、顕微鏡イメージングとRNAダイナミクス解析を併用したマルチモーダル1細胞解析実験系の確立です。細胞内において一定期間内で新規に合成されたRNA（新生RNA）をラベルするための“RNAラベル化剤”は、(１）細胞に取り込まれ、転写中のRNA上の塩基を部分的に置換する、（２）化学反応などを介して特徴的なシグナルを誘導することでシーケンシング装置を用いて１塩基の解像度で読み出せる、という条件を満たすことが望まれます。
本研究初年度では、RNAラベル化剤としてformyl化モノヌクレオシドを用いる検証を行いました。任意の位置に修飾RNAを導入したRNAをin vitro 転写合成反応を用いて調整し、この修飾RNAモデルを用いて、formyl化モノヌクレオシドへの化学反応の条件（pHやバッファー条件）やRNAシーケンシングに必須となる逆転写反応の条件（使用酵素や反応温度、逆転写反応の基質濃度など）の検証を行いました。最終的に、formyl化モノヌクレオシドのシグナルが検出できることを確認するとともに、シグナル強度に影響する条件として逆転写反応の基質濃度が重要である可能性を見出しました。そこで、各種反応条件のシグナル強度への影響について定量的部評価するため、Illumina社シーケンサーを用いた実験系を立ち上げました。
また、修飾モノヌクレオシドを添加した培地で培養した細胞から全RNAを抽出・酵素分解し、修飾モノヌクレオシドの導入量を高速液体クロマトグラフィー連結の質量分析装置で解析する実験系を立ち上げました。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
年度中に所属変更となり研究の開始時期が大幅に遅れましたが、当初の初年度計画通り、修飾RNA分子のシーケンシング条件の最適化に必要となる実験系や、培養細胞を用いたRNAラベルの取り込み率の評価系を立ち上げましたので、概ね順調に進行していると判断します。
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| 今後の研究の推進方策 |
Illumina社のシーケンサーを用いてformyl化モノヌクレオシドの読み出し効率を定量的に解析することで、各種反応条件の最適化を進めます。また、細胞の光刺激と新生RNAラベリングを併用した実験系を立ち上げ、formyl化モノヌクレオシドが期待通りに既存のRNAラベル化剤と差別化できる性質を持つかどうかを検証します。
本研究の到達目的である、顕微鏡イメージングと新生RNAラベリングを併用したマルチモーダル遺伝子制御ダイナミクス解析実験系の確立に向けて、顕微鏡画像の取得・解析パイプラインの作成を進めます。
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