| 研究課題/領域番号 |
22K05397
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
八代田 陽子 国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 副チームリーダー (60360658)
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| 研究分担者 |
平井 剛 九州大学, 薬学研究院, 教授 (50359551)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | 細胞間コミュニケーション / 分裂酵母 / オキシリピン / 生合成 |
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| 研究実績の概要 |
細胞が分泌する化合物を媒介物質として行う細胞間コミュニケーションは、微生物が環境に適応するための生存戦略と言える。研究代表者らは、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）が示す奇妙な「適応生育」現象の発見から、S. pombeがオキシリピンをつかって同種細胞間コミュニケーションを行い、窒素源取り込みを制御していることを発見した。本研究では、このオキシリピンの生合成経路や産生条件を、遺伝子過剰発現株ライブラリーと質量分析技術を用いて同定する。また、異種酵母によるNSF産生量も測定し、環境における同種、異種酵母とのコミュニケーションについて考察する。本研究は、S. pombeの「化学コミュニケーション＝種の生存戦略」の意義を、コミュニケーション因子の生合成の観点から明らかにすることを目的とする。2022年度は質量分析によるNSF定量法および薄層クロマトグラフィーによるNSF検出法を確立した。これにより、分裂酵母の培養上清や細胞内のNSF量を測定することができるようになった。また、酸化還元酵素関連遺伝子の過剰発現株を用いたスクリーニングから、NSF生合成経路に関わる遺伝子候補をいくつか見出した。次年度は確立したNSF定量法・検出法をもとにBioconversion実験やNSF生合成に関与する遺伝子のスクリーニングをさらに進め、また、異種酵母を用いた適応生育活性の検討を開始する。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
2022年度はまず、NSF定量法について検討を行った。予備検討条件をもとに、分裂酵母の培養上清の酢酸エチル抽出物よりNSF（10(R)-acetoxy-8(Z)-octadecenoic acid（Ac8Z）および10(R)-hydroxy-8(Z)-octadecenoic acid（Hy8Z））および不活性型のE体（Hy8E）をLC-MSを用いて定量する方法を確立することができた。定量用の内部標品にはOleic acid alkyneを使用した。また、細胞内に含まれるNSFを検出するための抽出法も検討した。培養液から遠心・回収した細胞を、クロロホルムとメタノールで細胞内粗脂質を抽出して乾固することによりNSF（Ac8Z, Hy8Z）およびHy8Eの定量に成功した。Bioconversionの検討では複数の条件を試行するため、それらのサンプルをLC-MSよりも低コストかつ簡便に確認する必要があった。そこでLC-MSを用いず、薄層クロマトグラフィー（TLC）を用いてオレイン酸、NSF（Ac8Z, Hy8Z）を分離させる条件を検討し、方法を確立した。NSF生合成関連遺伝子の探索については、S. pombeの遺伝子過剰発現株ライブラリーの中から、酸化還元酵素関連遺伝子を約20個選抜して、それぞれの培養上清から酢酸エチル抽出物を調製してNSFを定量して、候補遺伝子を絞り込んだ。
以上のことから、おおむね順調に進んでいると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
前年度に確立したTLCアッセイ法を用いて、Bioconversionの検討を行う。オレイン酸の非標識体とともに、ラベル体も検討し、in vitroにてオレイン酸がNSFに変換されるかどうかを確認する。研究代表者らはかつてBioneer社の「非必須」遺伝子破壊株コレクションのおよそ3,400株について、寒天培地上での適応生育誘導を指標としたバイオアッセイを実施し、生合成遺伝子の同定を試みたが、分裂酵母細胞はNSF以外にも適応生育活性をもつ物質を分泌する可能性もあるため、残念ながらこのバイオアッセイでは、NSF自体を分泌できずに適応生育を誘導できなくなった株を見出すことができなかった。今回、確立したTLC法、LC-MS法によりNSF産生量を測定することにより、あらためて分裂酵母の非必須遺伝子の破壊株ライブラリーをスクリーニングして関連遺伝子を同定する。また、異種酵母の適応生育活性の検討を開始する。S. cerevisiaeおよびS. japonicus、S. octosporus、S. cryophilusを用いて、寒天培地上でのS. pombeのeca39破壊株の適応生育試験を実施する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
おおむね計画通りに予算執行したが、業者による割引率の変動等があり、端数が17円生じた。17円は次年度に有効に活用させていただく。
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