| 研究課題/領域番号 |
22K05403
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| 研究機関 | 山梨大学 |
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研究代表者 |
舟根 和美 山梨大学, 大学院総合研究部, 教授 (90353953)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | サイクロデキストリン / 環状イソマルトオリゴ糖 / グルカンスクラーゼ |
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| 研究実績の概要 |
Paenibacillus sp. 598K 株は澱粉からCDとCIを生産する菌株であるが、CIよりもCDの生産量が圧倒的に多い。本菌株を澱粉原料から効率よくCIを生産する菌株に改良することを目的として、CD合成酵素（CGTase）をコードする遺伝子である2454 geneを相同組み換えによって遺伝子破壊することを計画した。まず、598K株に導入するための変異プラスミドの構築を試みた。CGTase 遺伝子の上流および下流領域をPCRで増幅し、それらを繋ぎ合わせることでCGTaseの活性中心部分を取り除いた変異DNA断片を作成した。pMADを用いて遺伝子破壊ベクターの構築を試みたが、シーケンス解析の結果から、目的の変異プラスミドを得ることができなかった。
不溶性グルカンを生産する乳酸菌であるLeuconostoc citreum S-32株は3種類のグルカンスクラーゼ遺伝子を有するが、これまではそのうちどれが環状イソマルトオリゴ糖に分岐（アンカー）を転移する酵素であるか不明であったが、このうちLOCUS_14650遺伝子産物を解析した結果、この組換えタンパクはスクロース分解活性を持ち、不溶性グルカンを生産するグルカンスクラーゼであると推定された。本酵素を用いてCIへの分岐鎖導入反応を行いHPLC分析を行った結果、アクセプタ基質であるCIと異なるピークを確認することが出来た。CI-7には分岐鎖が2つあるいはグルコ２糖からなる分岐鎖が１つ結合し、CI-8については分岐鎖が1つ結合したアンカー型CIが生産されたことが示唆された。この分岐鎖の結合様式については組み換え酵素の生産するグルカンの大半がα-1.3結合であると推定されることから、グルコース鎖がα-1.3結合でCIに結合している可能性が高い。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
Paenibacillus sp. 598K株のCGTase遺伝子破壊実験については、遺伝子破壊ベクターの構築から困難な状況である。Leuconostoc citreum S-32株については、これまで推定アミノ酸配列から破壊すべきグルカンスクラーゼ遺伝子を決めていたが、このたび残すべき遺伝子がLOCUS_14650遺伝子であることを明らかにすることができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続きpMADベクターを用いてPaenibacillus sp. 598K株のCGTase遺伝子破壊を進めていく。Leuconostoc citreum S32株については、LOCUS_14650遺伝子がコードするグルカンスクラーゼがCI-7およびCI-8にアンカーを導入することを、アクセプタ反応生成物を分離精製して質量分析やNMR分析で明らかにする。
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