| 研究課題/領域番号 |
22K05515
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| 研究機関 | 東京農業大学 |
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研究代表者 |
小西 良子 東京農業大学, 応用生物科学部, 教授 (10195761)
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| 研究分担者 |
三宅 司郎 麻布大学, 生命・環境科学部, 教授 (00575128)
服部 一夫 東京農業大学, 応用生物科学部, 教授 (10385495)
大仲 賢二 麻布大学, 生命・環境科学部, 准教授 (60257293)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | 乳酸菌 / アフラトキシン / デオキシニバレノール / SPR / 結合能 |
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| 研究実績の概要 |
目的：今年度は昨年度確立した表面プラズモン共鳴法（SPR）による測定法を用いて、生菌、死菌および精製した菌体成分に対する、アフラトキシンM1（AFB1）とデオキシニバレノール（DON）との結合能を検討した。使用菌株はきゅうり由来乳酸菌(きゅうり由来菌、Lactcoccus lactis subsp. Lactis AZ 132株)、陰性対象としてBacillus subtilis（NBRC 13719）を用いた。結合能は、in vitro法での結果と比較をしてSPR測定の妥当性を考察した。
実験方法：常法で培養した乳酸菌の粗菌体膜画分、ペプチドグリカン画分はTanakaらの方法で作成した。生菌、熱処理死菌体は昨年度と同じ方法で作成した。SPRのリガンドとしてAFM1-牛血清アルブミン（BSA）とDON-BSAを用いた。In vitro法は乳酸菌とAFM1またはDONを試験管内で1時間振とうし、遠心後上澄みのカビ毒をHPLC法で測定する方法で行った。SPR法は、生食に浮遊させた菌体などをリガンド上に流し、結合能をオンラインで光学的に測定した。
結果及び考察：SPRを用いた測定では、生菌はBSA-AFM1に強い結合が、DON-BSAに弱い結合が見られた。熱処理、粗菌体膜画分及びペプチドグリカン画分ではいずれのリガンドにも結合がみられなかった。一方in vitro法ではAFM1に対しては生菌で56% ,熱処理菌で45%、DONに対しては生菌で1.6% 熱処理菌で8.5%の結合率であった。この結果から、生菌を用いた場合にはSPRとin vitro法では同等の結果が得られることがわかり、SPR測定法との妥当性があると判断された。また、生菌でしか同等性がみられなかったのは、ＳＰＲ法では遠心操作をしていないことから、重力的な影響のない流体条件のみの反応が反映されたためと考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初の目的は、乳酸菌とカビ毒の結合能が、菌体成分のどこに由来するのかをSPR法で検討することであったが、今年度の研究結果からSPR法では死菌および分画した成分では結合しないことが明らかになったため、今まで結合能を測定する従来方法とされたin vitro法（バッチ法）との違い、すなわち迅速性と体内反応をモデル化できる流動的状態での反応に焦点をあて、SPR法を用いて微生物とカビ毒の結合能の測定法の開発を進めることとした。体内反応をモデル化に着目したのは、従来方法であるin vitro法は、振とうによる衝突および遠心による重力の影響を受けるため、ペプチドグリカンなど網目構造をとる部分に入り込んで、結合能と評価される可能性があるが、SPR法では流動的な動きのみであることから、菌体全体の電荷状態や表面構造が大きく影響し、瞬間的な結合が反映されると考えられたからである。得られた結果から方向性を変えたが、カビ毒との結合能を有する機能性微生物とカビ毒との結合能に関する研究の骨子は変わらず、おおむね順調に進んでいる。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度からの研究計画は以下の２つの課題を掲げる。
①酵母および乳酸菌のSPRを用いたカビ毒結合能のスクリーニング法の確率
乳酸菌以外にもカビ毒に結合能を示す微生物は報告されている。とくに酵母、特に細胞壁はカビ毒吸着材として市販されているものもある。そこで、SPRを用いた結合能のスクリーニング法を、乳酸菌および酵素で確立し、サプリメント等に有益な微生物の簡易迅速に検出する技術に資する。また、疎水性カビ毒をもつリガンド（フモニシン-BSA）と結合しやすい条件をSPRで検討する。
②カビ毒の生物学的デトックス法についてシステマティックレビュ―を行う。
上記のスクリーニングで検索されたカビ毒結合能のある微生物に対する今後の応用範囲についてシステマティックレビュ―から得られた知見を加え、総合的にその有効性を考察する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
２年目に計画していた国際学会への発表や論文発表が遅れており、最終年へ繰り越されたため次年度使用額が使用計画と差異が生じた。最終年度で上記の計画を行う予定である。
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