| 研究課題/領域番号 |
22K05676
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
早川 徹 岡山大学, ヘルスシステム統合科学学域, 助教 (30313555)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | 殺虫トキシン / 蚊の防除 / Bacillus thuringiensis / 微生物殺虫剤 / 小孔形成トキシン |
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| 研究実績の概要 |
ヒトや環境に優しい微生物殺虫資材、土壌細菌Bacillus thuringiensis由来のCryトキシンは、標的細胞膜上に小孔を形成するトキシンである。しかし「小孔形成」と「殺虫活性」の関連は未だ不明な点が多く、それを明らかにすることが喫緊の課題となっている。そこで本研究ではCryトキシンの膜貫入領域を標的にした変異導入解析を通してこの課題を解決しようと考えた。
殺蚊Cry4Aaトキシンの膜貫入領域(α4-α5)、特にトキシン小孔内腔側を構成するα4ヘリックスの極性アミノ酸残基をグルタミン酸(E)に置換した変異体(6種)を作製した。解析の結果、変異体の殺虫活性はトキシン小孔のコンダクタンス(イオン透過性)、そしてカチオン選択性(PK/PCl値)と相関していた。特にα4ヘリックスのH178残基を置換した変異体(H178E)では、トキシン小孔のカチオン選択性が減少することで殺虫活性が大きく減少すると考えられた。H178はCry4Aa小孔のイオン透過性に直接的/間接的に関与するアミノ酸残基であり、殺虫活性を制御可能なホットスポットの一つと考えられた。
殺蚊Cry46Abトキシンの膜貫入領域であるβヘアピン(β8-β9)にも同様なホットスポット(K155)が見つかっている。そこで本研究ではK155をランダムなアミノ酸残基に置換した変異体のライブラリを構築した。合計160クローンの変異体をスクリーニングした結果、16種類に変異体が得られ、中には殺虫活性が上昇した変異体も複数種見つかった。電気生理学的解析の結果、殺虫活性が上昇した変異体が形成するトキシン小孔ではカチオン選択性の上昇が観察された。本研究の結果からトキシン小孔のコンダクタンス及びカチオン選択性が殺虫活性の決定要因になりうること、これらは膜貫入領域を標的とする変異導入によって改変可能であることが明らかになった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度は構造が異なる2種の殺蚊Cryトキシン(Cry4AaとCry46Ab)に注目して、それぞれの膜貫入領域を標的とした変異導入解析を進めた。Cry4Aaではα4ヘリックスの極性アミノ酸残基をグルタミン酸(負電荷を持つ極性残基)に置換した変異体を構築して、トキシン小孔のイオン透過性、さらには殺虫活性に大きく影響するホットスポットを一カ所特定した。またCry46Abではすでに特定されているホットスポット(K155)を標的にランダム変異を導入し、殺虫活性が上昇した変異体を複数得るにいたった。解析はトキシン膜貫入領域の一部でしか行われていないが、初年度の成果としてはおおむね順調に進展していると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
初年度は構造が異なる2種の殺蚊Cryトキシン(Cry4Aa, 3ドメイン型; Cry46Ab, アエロリシン型)それぞれにおいて、膜貫入領域を標的とした変異導入解析を行った。Cry4Aaではトキシン小孔の内腔側を構成するα4ヘリックスの極性アミノ酸残基を標的とした解析を行い、変異導入によってトキシン小孔のコンダクタンス及びカチオン選択性が変化すること、その結果として殺虫活性も変化することを示した。特にα4ヘリックスのH178はトキシン小孔のカチオン選択性、さらには殺虫活性を制御しうるホットスポットであることが判明した。そこで今後はH178にランダム変異を導入してトキシン小孔のイオン透過性、及び殺虫活性の関連を詳しく調査する。またα4ヘリックスの他の領域についてもランダム変異導入を基にした網羅的な解析を進める。トキシン小孔の構造とイオン透過性の関係、特にイオン選択に機能する部位の解析などを進める。
またCry46Abでは特定されているホットスポット(K155)を標的としたランダム変異解析を行い、殺虫活性が上昇した変異体を複数得ている。本研究では変異体ライブラリのスクリーニングにアカイエカ幼虫を用いた簡易的バイオアッセイを導入しており、これがスクリーニングの効率化に大きく寄与した。そこで今後は標的をトキシンの膜貫入領域(β8-β9)全体に拡げてさらなるホットスポットの特定を試みる。複数の変異を組み合わせて殺虫活性をさらに改良する方法についても試行を始める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究は主に「変異体の作製」、「殺虫活性の解析」、「トキシン小孔の電気生理学解析」で構成される。特に「殺虫活性の解析」はアカイエカ幼虫の飼育やバイオアッセイなど、多くの労力が必要な作業となる。次年度使用額が生じた理由は、主に「殺虫活性の解析」の進展が新型コロナ対応等で滞ったためである。状況は改善しつつあり、残額は次年度に予定通り使用する。
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