| 研究課題/領域番号 |
22K05678
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| 研究機関 | 徳島大学 |
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研究代表者 |
石丸 善康 徳島大学, 大学院社会産業理工学研究部(生物資源産業学域), 講師 (50435525)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | ROS / 細胞老化 / Myoglianin / 酸化ストレス / 寿命 / コオロギ / RNA-seq |
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| 研究実績の概要 |
モデル動物の長寿変異体あるいは短命変異体は、酸化ストレスに対して抵抗性あるいは感受性を示すことから、寿命の長短と老化は酸化ストレスに依存する可能性が示唆されている。脊椎動物においても、また昆虫においても細胞内で活性酸素種(ROS)の増加と抗酸化能力の低下が酸化ストレスとなり細胞老化が誘導される。Myoglianin(Myo)遺伝子を欠損したコオロギは寿命が延長される（未発表データ）ことから、本研究では長寿モデルとしてMyoノックアウト(KO)コオロギを用いてROSレベルの制御と細胞老化誘導の分子機構解明を目指している。
Myo KO個体と野生型のコオロギ幼虫からRNAを抽出し、2群間比較によるトランスクリプトーム解析(RNA-Seq)を行い、ROS産生とその代謝に関連する因子に着目してMyoの標的候補因子を探索した。その結果、ROSを分解する抗酸化酵素GPXとCATの発現上昇が認められた。そこで、GPXとCATのクローニングを行い、RNA干渉(RNAi)により個々の遺伝子に対する機能阻害を行った結果、いずれも急速に生存率が低下し、約70%の平均寿命短縮が見られた。さらに、長寿命となるMyo KO個体を用いた解析でも、同様の寿命短縮効果が見られた。一方、RNA-Seq 解析の結果から、ROSの産生酵素であるNoxとDuoxの発現が減少しており、RNAiによる機能解析を試みたが寿命に影響は見られない結果となった。NoxとDuoxは、計7種類のホモログが機能していることから、複数同時のRNAiや実施時期などを今後検討する必要がある。
RNA-Seq解析からMyoの標的因子にROS産生酵素と抗酸化酵素が含まれており、MyoはROSの生産と分解の両方に機能してROSレベルを制御している可能性が示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
Myo KOを用いたRNA-seq解析の結果から、ROS産生酵素と抗酸化酵素の発現が変動していることを明らかにした。野生型またはMyo KOコオロギを用いた抗酸化酵素のRNAiによる機能解析の結果、生存率の低下と寿命の短縮が確認された。一方、ROS産生酵素のRNAiでは、寿命に影響は認められていない。
本年度の計画では、Myo KOもしくはRNAi個体における細胞老化の割合を評価するため、老化細胞マーカー遺伝子の定量PCRによる発現解析とSA-β-Gal活性の測定を予定していた。さらにROSの定量と抗酸化酵素活性を調べることで、ROS制御と細胞老化誘導におけるMyoの機能解明を目指していたが、まだ至っていないため、当初の予定よりやや遅れているといえる。
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| 今後の研究の推進方策 |
Myoの機能がROSの産生と分解に関わる可能性が示唆されたことから、令和5年度は、Myo KO及びRNAi個体においてROSレベルの定量と抗酸化酵素活性の測定を行う。また、老化細胞の検出指標として老化細胞マーカー遺伝子の定量PCRによる発現解析とSA-β-Gal活性を測定し、細胞老化の割合を比較評価する。本解析により得られる結果から、ROSと細胞老化の制御に関わるMyoの機能を明らかにする。
さらに、野生型の成熟成虫と高齢成虫およびMyo KO個体とMyo RNAi高齢成虫からRNAを抽出してRNA-Seq解析を行い、ROS制御および細胞老化に関連するMyoの標的候補因子をさらに探索する。Myo KO個体で標的候補因子のRNAiまたはCRISPR/Cas遺伝子ノックイン(過剰発現)解析を行い、KO表現型のレスキュー効果を評価する。さらに、SA-β-Gal活性とROS濃度の測定・解析することにより、細胞老化誘導に関わる一連の分子機構を明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
(理由)Myo KO条件下で発現変動するROS制御の関連因子を探索し、RNAiによる機能性スクリーニングを優先して遂行しており、当時予定していたROSの定量と細胞老化割合の比較評価が遅れている。令和4年度の研究費に未使用額が生じたが、研究計画に変更はなく、前年度の研究費を含めて今年度行う予定の研究計画と併せて実施していく。
(使用計画) 使用計画は以下のとおりである。
ROSの定量分析と抗酸化酵素活性を測定することで、ROS制御に関わるMyoの機能を明らかにする。また、老化細胞マーカー遺伝子の定量PCR発現解析とSA-β-Gal活性を測定し、細胞老化におけるMyoの機能を明らかにする予定である。さらに、RNA-seq解析を実施し、Myoの下流で細胞老化に関わる標的候補因子を探索する。標的因子のRNAiまたはCRISPR/Cas遺伝子ノックイン(過剰発現)解析を行い、Myo KO表現型のレスキュー効果を評価する。また、SA-β-Gal活性を解析することにより、細胞老化誘導に関わる一連の分子機構を明らかにする予定である。
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