| 研究課題/領域番号 |
22K05939
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| 研究機関 | 北海道医療大学 |
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研究代表者 |
堀内 正隆 北海道医療大学, 薬学部, 准教授 (90322825)
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| 研究分担者 |
永田 崇 京都大学, エネルギー理工学研究所, 准教授 (10415250)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| キーワード | ハイブリッド酵素 / セルラーゼ / セルロース / 好冷菌 / タンパク質工学 |
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| 研究実績の概要 |
令和4年度は、低温型ハイブリッドセルラーゼの酵素ユニットのうち、Sclerotinia borealisの溶解性多糖モノオキシゲナーゼ (sbLPMO) について、大腸菌、Pichia pastorisおよびBrevibacillusを宿主とした発現を試みた。S. borealisには3種類のLPMO候補遺伝子が存在していたため、それらをすべて発現ベクターにクローニングした。大腸菌では、組換えタンパク質はすべて不溶性画分として得られたことから、複数の条件下での可溶化やリフォールディングを試みたが、活性のある可溶化酵素は得られなかった。Pichia pastorisにおいては、そもそも目的タンパク質の発現を確認できなかった。これらに対し、Brevibacillusでは、2種類のsbLPMO遺伝子について、培地画分に組換えタンパク質が確認された。
発現したsbLPMOは、C末端側に付加したHis-tagを利用して、Niキレートカラムによるアフィニティー精製した。過酸化水素の存在下で、得られたsbLPMOのうちの1種類について2,6-ジメトキシフェノールの分解活性を調べたところ、pH 8のときに最大の活性を示すことが明らかとなった。
その他に、新規の酵素ユニットとして、S. borealisのセロビオースデヒドロゲナーゼ (sbCDH) のクローニングを行った。ただし、sbCDHの塩基配列は、データベース上のゲノムベースの配列とは異なる部分が複数存在することから、現在、他の種のCDHとの配列比較を行い、sbCDHの塩基配列の妥当性について検討している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ハイブリッド酵素の酵素ユニットの個別生産のうち、当初2年間に実現すべき2種類のうち、1種類目の生産に成功したため。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、ハイブリッド酵素の酵素ユニットの個別生産のうち、当初2年間に実現すべき2種類目の生産を実現し、それぞれの酵素活性を測定する。活性が確認できた酵素ユニット同士を、遺伝子工学的あるいはタンパク質化学的に接続したハイブリッド酵素を作製する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初要求では、2022年度中に低圧クロマとグラフィー装置の購入する予定で予算を計上したが、新型コロナウィルス感染流行が続いていたため、購入前の性能確認を行うことができず、購入計画を保留した。2023年度にあらためて性能確認を行い、研究代表者の要求に見あった性能であれば、購入する予定である。
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