| 研究課題/領域番号 |
22K06115
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
海野 英昭 長崎大学, 工学研究科, 准教授 (10452872)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | AMPD / X線結晶構造解析 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、Candidatus Promineofilum breve 由来ホスホトランスアンヒドロメバロン酸デカルボキシラーゼ(PbrAMPD)の結晶構造解析による反応機構の解明を目的として、研究を進めている。
本年度は、大腸菌（BL21(DE3)）を用いた PbrAMPD の発現と精製、および結晶化条件検討を実施した。 結晶化条件の検討には、初期スクリーニングで結晶が得られた条件を元に、条件の最適化を行う事で良質な結晶の作成に成功し、その結晶の放射光測定により分解能 3.2 オングストロームの回折データを収集した。その回折データを用い、PbrAMPD と相同性を有するタンパク質構造を用いた分子置換方法により、PbrAMPD の構造決定に成功した。この PbrAMPD はその配列の相同性からUbiDファミリーに属しているが、既知のUbiDファミリータンパク質の構造とはドメインの配置が一部異なっていることが分かった。この構造の違いが、PbrAMPDの有する基質特異的な反応機構と深く関係していることが推測された。
PbrAMPDのより詳細な反応機構解明のためには、FMN およびその誘導体である PrFMN との結合型ホロ酵素の構造解析が必要である.。このことから、現在 FMN 結合型 PbrAMPD の結晶化の検討を進めている。FMN - PbrAMPD 複合体の動的光散乱測定を行った結果では、FMN との複合体化に伴い、PbrAMPD の分子形状に変化が生じていることを確認している。今後は FMN-PbrAMPD および PrFMN-PbrAMPD 複合体の結晶構造の決定及びその構造解析を行い、PbrAMPD の FMN 結合による構造変化、および基質である tAHMP との反応機構の詳細を明らかにしたいと考えている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
アポ型 PbrAMPD の結晶を作成し、その放射光測定により分解能 3.2 オングストロームの回折データ収集を行なった。その回折データを用い、分子置換法によりアポ型 PbrAMPD の結晶構造を決定した。PbrAMPD の構造解析による反応機構解明を本研究目的とする中で、このアポ型 PbrAMPD の結晶構造決定は大きな前進であると言える。
今後は、補酵素フラビンとの複合体である FMN-PbrAMPD、およびホロ型（活性型）であるプレニル化フラビンとの複合体（PrFMN-PbrAMPD複合体）の結晶化および構造決定へと進める予定であり、進捗状況は順調に推移している。以上の事から、本年度の進捗状況は概ね順調に進展していると判断できる。
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| 今後の研究の推進方策 |
FMN-PbrAMPD複合体の結晶化条件検索およびその条件の最適化を行い、得られた結晶を用いて放射光測定、およびその結晶構造決定を行う。それにより決定した構造情報およびその結晶化条件を用いて、ホロ型（活性型）であるPrFMN-PbrAMPD複合体の結晶化およびその結晶構造決定を行う。得られたそれらの構造的知見を統合することで、AMPDの反応機構を解明する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
R5年度はPbrAMPDの構造決定のため、タンパク質精製および結晶化の試薬類購入を優先し、かつその費用が当初見積もりより増加した事から、購入予定であった機器類（クロマトグラフィーシステムおよびオートクレーブ装置）の購入は見送った。それにより生じた差額は次年度使用へと繰り越す事とした。次年度においても、タンパク質精製及び結晶化に十分な予算が必要な事から、機器類の購入はキャンセルとし、このR6年度への繰越し予算はタンパク質精製及び結晶化の試薬・器具の購入費用とする予定である。
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