| 研究課題/領域番号 |
22K06143
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
梶浦 裕之 大阪大学, 生物工学国際交流センター, 助教 (30704209)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | 糖鎖工学 / N-結合型糖鎖 / 糖転移酵素 / 植物での一過的発現 / 抗体 / エフェクター機能 |
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| 研究実績の概要 |
本年度はまず、本課題で使用する抗体上のN-結合型糖鎖の非還元末端側への糖転移に必要な動物、植物、昆虫由来の糖転移酵素を3種類取得した。植物(Nicotiana benthamiana、ベンサミアナタバコ)を宿主とし、取得したそれぞれの糖転移酵素をモデル抗体とアグロインフィルトレーションにより一過的に共発現させ、その抗体上のN-結合型糖鎖構造の改変を試みた。その結果、共発現した糖転移酵素が機能したことにより植物内では通常生合成されないN-結合型糖鎖構造がモデル抗体上で確認できたが、異種糖転移酵素を単純に植物に導入するだけでは効率よく抗体上のN-結合型糖鎖構造を目的の構造に改変するには不十分であることも確認できた。同時に、植物由来の糖転移酵素の導入(過剰発現)では、植物内在性の酵素によるN-結合型糖鎖修飾を加速させ、目的とする構造のN-結合型糖鎖を合成できない問題点も見出した。
次に細胞内、特にゴルジ体局在を制御するそれぞれの糖転移酵素上の局在化因子を植物由来のゴルジ体局在化因子に置換したキメラ糖転移酵素発現用コンストラクトを合計21種類作製した。そのうち7種類のキメラ糖転移酵素をそれぞれモデル抗体とベンサミアナタバコでアグロインフィルトレーションにより一過的に共発現させ、モデル抗体の発現を確認した。発現が確認できたモデル抗体をベンサミアナタバコの葉からプロテインAカラムを用いて精製し、次年度以降にN-結合型糖鎖構造解析が実施できる量を確保した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
採択前より準備を進めていたこともあり、異種糖転移酵素を単純にベンサミアナタバコに導入しただけでは抗体上のN-結合型糖鎖構造を効率よく改変できないことを早期に確認できた。また、当初の予定よりも早い段階で今後の研究に使用するキメラ糖転移酵素発現用コンストラクトの作製が完了した。モデル抗体との共発現も確認でき、またその精製系も構築できた。これら研究と並行して、次年度以降に実施する抗体上のN-結合型糖鎖構造を推定する分析系も構築できたことから、当初の計画以上に進展していると評価した。
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| 今後の研究の推進方策 |
一過性発現で調製し、その後精製した7種類のN-結合型糖鎖改変モデル抗体をSDS-PAGEとCBB染色で精製度を確認する。モデル抗体のH鎖をCBB染色したゲルより切り出し、切り出したゲルのゲル内トリプシン消化を実施し、nanoLC-MS/MS解析を行う。得られたnanoLC-MS/MS解析のクロマトグラムより糖ペプチド断片を検出し、その全N-結合型糖鎖構造と比率を推定する。同時にベンサミアナタバコでアグロインフィルトレーションによる一過性発現により、残りの14種類のキメラ糖転移酵素に関してもモデル抗体と共発現させ、その発現と精製を試みる。
また植物由来の糖転移酵素の導入(過剰発現)時に確認された、N-結合型糖鎖修飾を加速させる内在性糖鎖修飾関連酵素のゲノム編集植物の作製にも着手する。
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