| 研究課題/領域番号 |
22K06173
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
平野 美奈子 岡山大学, ヘルスシステム統合科学学域, 准教授 (80585167)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | 光遺伝学 / イオンチャネル |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、cAMP依存的に開閉するイオンチャネル（CNGチャネル）を利用して、光活性化アデニル酸シクラーゼ（PAC）の特性の調整機構を解明し、細胞機能の光操作に適した新規PAC改変体群を創製することを目的としている。本年度は、PACが産生するcAMP量を捉えるのに適したCNGチャネルの選定を行った。詳細を下記に記す。
CNGチャネルの一種であるHCN2チャネルとSthKチャネルのcAMP感受性を比較した。これらのCNGチャネルをアフリカツメガエルの卵母細胞にそれぞれ発現させ、細胞内cAMP濃度の変化に伴うチャネル電流の変化を計測した。HCN2チャネルを発現させた卵母細胞では、フォルスコリンの添加または共発現させたPACへの光刺激によってcAMP産生を促さなくてもチャネル電流が捉えられ、これらの刺激によりcAMP量を高めてもチャネル電流に変化はなかった。一方、SthKチャネルでは、フォルスコリンの添加前後でチャネル電流に変化が見られた。ELISA法によるcAMP濃度の測定により、卵母細胞内には元々約1 μMのcAMPが存在していたことから、HCNチャネルは1 μM程度のcAMPで完全に活性化されると考えられる。一方、SthKチャネルが活性化された条件での細胞内cAMP濃度は200 μM以上であったことから、SthKチャネルは数100 μM以上のcAMPが活性化に必要なことがわかった。これらのことから、PACの特性を調べる際、活性が低い、つまり産生されるcAMP量が少ない場合にはHCN2チャネルを、活性が高い場合にはSthKチャネルを用いれば、特性を捉えられることが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度、PACの特性を捉えるためのCNGチャネルのcAMP濃度依存性を明らかにすることができたため、今後この情報を基にPAC毎に適した種類のCNGチャネルを使うという道筋が立った。
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| 今後の研究の推進方策 |
今回特性を調べたHCN2チャネルとSthKチャネルを昆虫細胞または大腸菌で発現・精製し、電気生理学的手法の一つである人工膜法でcAMP濃度依存的な変化が見られることを確認する。また、これら2つのCNGチャネルでカバーできないcAMP濃度を捉えるためのCNGチャネルを探し出す。その後、PACが光依存的に産生するcAMP量の変化を、人工膜に組み込んだこれらのCNGチャネルのチャネル電流の変化で捉え、PACの種類の違いによる特性の違いを明らかにする。得られた情報から特性に影響を与える部位を改変し、光応答能などを高めた変異体を作製してPACのオプトジェネティクスツールとしてのバリエーションを広げる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究を推進中に研究の鍵となるCNGチャネルの種類をさらに増やす必要がでてきたため、計画を見直す必要があったため。
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