ショウジョウバエ上皮細胞間隙バリア機能低下による幹細胞増殖の促進機構の解明

2022 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 22K06229
• 研究機関: 生理学研究所
• 研究代表者: 泉 裕士 生理学研究所, 生体機能調節研究領域, 准教授 (10373268)
• 研究期間 (年度): 2022-04-01 – 2025-03-31
• キーワード: 上皮バリア / 細胞増殖 / ショウジョウバエ / 幹細胞 / 組織恒常性 / 腸管 / 腎管／マルピーギ管 / セプテートジャンクション

研究実績の概要

私は、ショウジョウバエ腸管の細胞間隙バリアとして機能する細胞間結合「スムースセプテートジャンクション(sSJ)」の解析を進めてきた。その過程で、1)腸管には、sSJの機能低下を検知して幹細胞の増殖を促進し、上皮細胞の再生を促す仕組みが存在すること、2)sSJの機能低下による幹細胞の増殖促進において、細胞極性の制御分子として知られるaPKCが関わること、3)腎管（マルピーギ管）でもsSJの機能低下によって幹細胞増殖の促進が起こること、を見出した。そこで、本研究はショウジョウバエの腸管、腎管をモデルに、sSJの機能低下による幹細胞の増殖促進メカニズムを、特にaPKCを介したシグナル経路に注目し、解明することを目的とした。2022年度は、aPKCを介した幹細胞増殖に関わる分子を明らかにするために、腸管上皮細胞で活性型aPKCの発現を誘導することのできる系統を新たに作製し、解析を進めた。その結果、この活性型aPKC発現系統が、幹細胞の増殖亢進を示すことを確認した。さらに、以前にaPKCとの相互作用が示唆されたRhoGEFの発現抑制が、活性型aPKCによって亢進した幹細胞の増殖を有意に低下させることを見出した。従って、上皮細胞においてaPKC-RhoGEFを介した幹細胞増殖制御機構の存在が示唆された。
腎管幹細胞の領域特異的制御機構を解析するため、次の腎管領域特異的な温度感受性GAL4系統を作製した：近位尿細管 (myo1A-GAL4ts)、下部尿細管(31E09-GAL4ts)、上部尿細管／下部尿管 (c507-GAL4ts) 、下部尿管(c42-GAL4ts)。これらをUAS-mesh-RNAi系統と掛け合わせ、腎管上皮細胞でのsSJ機能低下を誘導したところ、腎管幹細胞の増殖亢進が観察された。これらは、腎管幹細胞の領域特異的制御機構を解析する有用なツールとなることが期待される。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

2022年度の計画として、先行研究により作出した、成虫腸管特異的にsSJ分子を欠失できるmesh-RNAi系統（myo1A-GAL4ts; UAS-mesh-RNAi）を用い、mesh発現抑制により誘導される幹細胞増殖亢進を低下させることが期待される候補分子のRNAi系統をテストする予定にしていた。しかし、myo1A-GAL4ts; UAS-mesh-RNAi系統を利用した解析では、安定した結果が得られないことが判明し、この系統を用いた解析は保留とした。現在は別のsSJ分子抑制系統（myo1A-GAL4ts; UAS-Tsp2ARNAi）を作製しており、この系統が同様の解析に利用できるか検討する。一方、期間中に腸管上皮細胞で活性型aPKCの発現を誘導することのできる系統（myo1A-GAL4ts; UAS-aPKCdeltaN）を新たに作製した。この系統と候補分子のRNAi系統と掛け合わせることにより、aPKCによる幹細胞増殖の制御に関わる分子の検索を試みた。その結果、候補分子としてRhoGEFを見出すことができた。
腎管幹細胞の領域特異的制御機構の解析に向けて、期間中に次の腎管領域特異的GAL4系統の温度感受性系統を作製した：近位尿細管 (myo1A-GAL4ts)、下部尿細管(31E09-GAL4ts)、上部尿細管／下部尿管 (c507-GAL4ts)、下部尿管(c42-GAL4ts)。さらに、UAS-meshRNAi系統と掛け合わせて、腎管幹細胞の挙動を観察したところ、その増殖亢進が観察された。今後これらを利用し、腎管幹細胞の領域特異的制御機構の解析を進める。

今後の研究の推進方策

成虫腸管上皮特異的にsSJ分子の発現抑制を引き起こすTsp2A-RNAi系統（myo1A-GAL4ts; UAS-Tsp2A-RNAi）を作製し、この系統で幹細胞増殖が亢進することを確認する。安定に幹細胞増殖の亢進が起こることが確認できれば、aPKC, Yorkie JNKのRNAi系統が増殖に対して影響を与えるか解析するとともに、候補RNAi系統（例えば、sSJ分子欠失を誘導した腸管において発現が大きく上昇するDlg, Lgl, Par6, Coracle, FasIIIなどのRNAi系統）が増殖に影響を与えるか解析する。
aPKCによる幹細胞増殖亢進への関与が示唆されるRhoGEFについて、別のRhoGEF-RNAi系統が同様の効果を示すか確認すると共に、どのRhoファミリーGタンパク質が関与するか解析する。さらに、aPKCとの遺伝学的相互作用、生化学的手法による分子間相互作用を解析し、aPKC-RhoGEF系の存在の確認を進める。また、sSJ分子の発現抑制による幹細胞増殖へのRhoGEF-RNAiの効果を解析し、sSJとaPKC-RhoGEFとの関連を調べる。
腎管幹細胞の領域特異的制御機構の解析に向けて、腎管領域特異的GAL4系統の温度感受性系統を作製し（近位尿細管 (myo1A-GAL4ts)、下部尿細管(31E09-GAL4ts)、上部尿細管／下部尿管 (c507-GAL4ts) 、下部尿管(c42-GAL4ts)）、これらとUAS-mesh-RNAi系統との掛け合わせにより、腎管における幹細胞増殖亢進が観察された。これらの系統を利用し、sSJ分子の発現抑制による幹細胞増殖亢進へのaPKC, Yorkie, JNK, Upd, EGFリガンドなど腸管幹細胞増殖の関連因子の関与を解析する。さらに、これらの関連因子の領域特異的な影響にも注目し、解析を進める。

次年度使用額が生じた理由

（理由）ショウジョウバエの維持、各種系統作成、購入と組織の蛍光免疫染色を中心に研究を進めた一方、分子生物、生化学実験を行う機会がほとんど無く、それらの関連試薬の購入経費が抑えられた。2学会に参加したが、そのうち1学会は近場での開催だったので、旅費が抑えられた。
（使用計画）実験量を増やす予定であり、それに伴いショウジョウバエ飼育関連の消耗品の購入量が増加すると思われる。 また、ショウジョウバエ系統のストックセンターからのショウジョウバエ購入も増加する予定である。国内学会について、2学会以上の参加を予定しており、旅費が増加する予定である。

研究成果

• [国際共同研究] University of Guelph(カナダ)
  • 国名: カナダ
  • 外国機関名: University of Guelph
• [雑誌論文] Identification of the genes encoding candidate septate junction components expressed during early development of the sea urchin, Strongylocentrotus purpuratus, and evidence of a role for Mesh in the formation of the gut barrier (2023)
  • 著者名/発表者名: Jonusaite Sima、Oulhen Nathalie、Izumi Yasushi、Furuse Mikio、Yamamoto Takashi、Sakamoto Naoaki、Wessel Gary、Heyland Andreas
  • 雑誌名: Developmental Biology 巻: 495 ページ: 21～34
  • DOI: 10.1016/j.ydbio.2022.12.007
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Shortened lifespan induced by a high-glucose diet is associated with intestinal immune dysfunction in Drosophila sechellia (2022)
  • 著者名/発表者名: Abe Maiko、Kamiyama Takumi、Izumi Yasushi、Qian Qingyin、Yoshihashi Yuma、Degawa Yousuke、Watanabe Kaori、Hattori Yukako、Uemura Tadashi、Niwa Ryusuke
  • 雑誌名: Journal of Experimental Biology 巻: 225 ページ: -
  • DOI: 10.1242/jeb.244423
  • 査読あり
• [学会発表] aPKCはショウジョウバエの腸管バリア機能の破綻に伴う腸管上皮幹細胞の増殖に関与する. (2022)
  • 著者名/発表者名: 泉 裕士、古瀬幹夫
  • 学会等名: 第74回日本細胞生物学会大会
• [学会発表] Septate junctions regulate renal stem cell proliferation in the Drosophila Malpighian tubules. (2022)
  • 著者名/発表者名: Izumi Yasushi, Furuse Mikio.
  • 学会等名: 第15回日本ショウジョウバエ研究会