| 研究課題/領域番号 |
22K06276
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| 研究機関 | 東京工業大学 |
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研究代表者 |
増田 真二 東京工業大学, 生命理工学院, 教授 (30373369)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | 葉緑体 / シロイヌナズナ / 光合成 / チラコイド膜 |
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| 研究実績の概要 |
本研究では、これまで筆者らが同定した、葉緑体包膜に局在しプロトンの膜透過を光依存的に行うDLDG1とYcf10、さらに葉緑体の包膜とチラコイド膜の両方に局在するFLAP1の遺伝学的・生化学的解析を進めることで、これら新規因子に依存した新たなプロトン膜移動の存在とその機能を明らかにすることを目指す。今年度の成果を以下にまとめる。
1)FLAP1の相互作用因子の同定: 先に作出したプロテインA(ProA)を融合したFLAP1を発現するシロイヌナズナ株を用いて、可溶化したチラコイド膜画分よりProA-FLAP1を精製を試みた。さまざまな界面活性剤をチラコイド膜の可溶化に供したところ、ジギトニンがProA-FLAP1を比較的よく可溶化させることがわかった。
2)dldg1変異体のサプレッサー変異体の単離: サプレッサー変異体のゲノムリシーケンシングのデータをもとに絞り込んだ遺伝子に着目し、そのWT遺伝子をそれぞれの相補体に導入することで、緑が回復した表現型がdldg1のペールグリーンの表現型に戻るかを指標に、サプレッサー変異体の原因遺伝子を確定することを目指した。その結果、葉緑体コード型RNAポリメラーゼ複合体のサブユニットをコードする遺伝子内にその原因変異があることがわかった。
3)シアノバクテリアの解析: 先に作出したpH指示タンパク質Luphinを発現させた各変異体を用いて、光照射に伴う細胞質のpH変化をリアルタイムでモニターすることで、各遺伝子産物の、光照射時の細胞質におけるpH変化に及ぼす影響を明らかにすることを試みた。その結果、WTにおいて、光照射時に細胞外pHが減少する時間帯では細胞内pHが上昇し、その後細胞外pHが上昇する時間帯では細胞内pHが減少することがわかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
おおむね予定された研究を実施することができたため。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでの成果を踏まえ、来年度は以下の実験を遂行する。
1)FLAP1の相互作用因子の同定: 先に作出したプロテインA(ProA)を融合したFLAP1を発現するシロイヌナズナ株よりチラコイド膜画分を精製し、ジギトニンによりProA-FLAP1を可溶化させ、その複合体の精製を試みる。精製後、質量分析によりFLAP1と相互作用しているタンパク質の同定を目指す。
2)dldg1変異体のサプレッサー変異体の単離: dldg1変異を相補する、葉緑体コード型RNAポリメラーゼ複合体のサブユニットをコードする遺伝子内の原因変異の解析を行う。具体的には、この遺伝子のノックアウト変異体を取り寄せ、dldg1との二重変異体を作出し、その機能解析を行う。
3)シアノバクテリアの解析: pH指示タンパク質Luphinを、FLAP1, DLDG1のシアノバクテリアホモログ（FlpA, DlgA, PxcA）変異体に導入し、それら変異体内における細胞内pH変化の光依存性を精査する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
組換え植物体の解析を行うための装置の部品が昨今の半導体不足により納入が遅れ、その実験に必要な備品・試薬の購入が先延ばしになったため。
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