| 研究課題/領域番号 |
22K06335
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| 研究機関 | 公益財団法人東京都医学総合研究所 |
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研究代表者 |
柴田 武彦 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, 研究員 (70087550)
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| 研究分担者 |
廣田 耕志 東京都立大学, 理学研究科, 教授 (00342840)
正井 久雄 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, 所長 (40229349)
笹沼 博之 公益財団法人東京都医学総合研究所, 基礎医科学研究分野, 副参事研究員 (00531691)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | 相同DNA組換え / 組換え中間体 / ヘテロ二重鎖DNA / ハイブリッド二重鎖DNA / 相同対合反応 / RecA / Rad51 / 相同組換え修復 |
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| 研究実績の概要 |
相同的組換えがDNA二本鎖切断を正確に修復してゲノムを維持する。相同的組換えの要は、切断端からできる単鎖(ss)DNA域が二重鎖(ds)DNAの中から互いに相同な配列を見つけハイブリッドds (Hyb-ds) を作る反応である。この反応の仕組みは未だに定説がない。単分子クライオ電子顕微鏡解析が示唆する、ある酵素がdsDNAの塩基対を開き、できたss域で相手のssDNAとアニールしてHyb-dsを作る「二重鎖開裂が先」モデルと、従来の生化学研究が支持する、ds構造が開く前にssDNAとの相同配列が見つけ出される「二重鎖開裂が後」モデルとがある。本研究の目的は、「二重鎖開裂が後」モデルにだけ想定される「相同並行三重鎖」の存在を示すことで、このモデルの確証を得る。ウイルスとミトコンドリア以外では、生物種に関わらず、ゲノムDNAの相同DNA組換えでは、RecAまたはそのorthologue (別種生物間で、共通の祖先を持ち同じ機能を担う遺伝子、それがコードする蛋白質）であるRAD51、DMC1がHyb-ds形成を行う。その原型であるRecA (蛋白質) は試験管内で高いHyb-ds形成活性を示すので本研究に最適であるが、形成したHyb-dsをＤループにして加工する機能を併せ持つ。そのため、Hyb-dsができた当初、相同並行三重鎖なのかＤループなのか未だに議論が決着しない。Ｄループ安定化と加工の要はRecAやRAD51, DMC1が単鎖DNAと形成するラセン繊維状構造の内側でＤループに接するL2ループ部位にあることが立体分子構造解析の結果から示唆されている。令和４年度は、L2ループの変異蛋白質の大量精製のシステムを確立し、必要な量の野生型RecAとL2ループ変異蛋白質を調製し、変異RecA (蛋白質) の生化学的な性状を明らかにするため、野生型RecAとの比較解析に着手した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
所属機関の変更により、実験場所が移ったために、本課題の実験開始が遅れ、主要な研究材料を全て新たに調製し直した。特に蛋白質精製については、精製システムを新規の機材で、全く新しく立ち上げる必要があった。結果的には、最新の機材で再現性が高い精製システムを構築することができた。当初は初年度で、変異RecAの精製と基本的な生化学的性状の解析を終える予定であったが、次年度へずれ込んだ。
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| 今後の研究の推進方策 |
研究計画に基本的な変更はない。L2変異RecAの生化学的な性状を明らかにするための野生型RecAとの比較解析、特に、Ｄループ形成、加工反応に対する変異RecAの変異効果の解析を早急に完了する。次に、DNA巻き戻し活性に対するL2ループ変異の効果の解析を行う。DNA巻き戻し活性の精密測定には切れ目がある環状二重鎖DNAを使う系を確立している。RecAは、切れ目がある環状二重鎖DNAに対して、超ラセンをもつ閉環状二重鎖DNA（両方のDNA鎖に全く切れ目がなく連続している）に比べて、Ｄループ形成効率が著しく低いことが知られている。一方、Hyb-dsを含む並行三重鎖形成に超ラセンが必要ない蛋白質（酵母ミトコンドリアの相同DNA組換えに必要なHyb-ds形成蛋白質、RecAと構造的な類似性があるが、それと違ってATPを必要としない）を既に見つけて発表している。RecAでも、Hyb-dsを含む並行三重鎖形成に超ラセンを必要としないことを期待しているが、超ラセンを必要とする可能性も十分にある。その場合、DNA巻き戻し活性測定方法を改良、または再構築する必要がある。以上の問題の検討が終わり次第、本題の三重鎖中間体の存在の検証を進めていく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
新たな実験場所を得て移る必要が生じ、本年度の研究開始が遅れたことで、未使用額分を繰り越した。次年度に繰り越したＤループの生成量の測定には32P放射性同位体で標識したDNAを用いる。標識に用いる[alpha 32P] Adenosine 5'-triphosphate (単位9.25 MBq \37,000) は半減期2週間なので、標識に用いるT4 Polynucleotide Kinase (単位500U￥11,000) と共に定期的な購入が必要。二重鎖DNA巻き戻し測定には、切れ目のある環状二重鎖DNA調製のための制限酵素 (単位500 U ￥12,000)とDNA ligase (単位25,000U ￥14,000) が必要。三重鎖形成に超ラセン二重鎖DNAを必要とした場合、DNA巻き戻しの測定システム立ち上げにはDNAトポイソメラーゼI（Wheat Germ Topo I 単位250 U \22,000) が必要となる。これらの実験には、多種多様なプラスチック機材を用いるため、それら (例えばピペット類 単価\15,000 - 20,000) の購入費用が必要。
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