| 研究課題/領域番号 |
22K06436
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| 研究機関 | 駒沢女子大学 |
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研究代表者 |
佐藤 勝重 駒沢女子大学, 人間健康学部, 教授 (80291342)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | 光学イメージング / 膜電位感受性色素 / 機能発生 / 機能形成 / 嗅神経 / 神経回路網 / 終脳 / 鶏胚 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、胎生期の終脳における嗅覚神経回路網の機能発生/構築過程を解明することを目的とする。研究方法としては、①膜電位感受性色素や、膜電位タンパクセンサーを用いたニューロン電位活動の光学的イメージング法による機能マッピングと、②カーボシアニン系蛍光色素や、rhodamine dextranを用いた形態マッピングを組み合わせた多角的解析を行う。具体的には、まず、発生初期の鶏胚を対象とした実験から、嗅覚神経回路の機能発生/構築過程の基本的プロフィルを明らかにし、さらに、実験対象をラット/マウス胎仔に広げて、個体発生と系統発生の両側面からデータの比較を行い、本命題の解明を進める。
令和4年度は、鶏胚「N.I-嗅球-終脳標本」を用いて実験を行った。まず、孵卵10日の標本を膜電位感受性色素で染色し、嗅神経を吸引電極で刺激し、終脳内の嗅覚神経回路網に関係する応答領域の同定を行った。さらに、"optical sectioning"を組みあわせることにより、光学的三次元機能マッピングを試みた。実験からは、波形解析を行うのに十分なS/N比を持つ光学シグナルが得られ、終脳内におけるニューロンの活動電位、興奮性シナプス後電位を分離することに成功した。
次に、孵卵10日の標本だけでなく、さまざまな発生段階の標本を用いて、その機能発生・構築過程を調べた。終脳における嗅神経関連の神経回路網の機能発生、発達について、基本的なデータを得ることができた。機能マッピンと形態マッピングとの比較を目的として、蛍光トレーサー（DiI）を嗅神経に付着させて、その広がりを観察した。終脳内の嗅覚神経回路網を構成する構造体（梨状皮質、前嗅核、嗅結節、扁桃体、海馬体、分界条床核など）の完全な同定にはまだ至らなかったが、次年度以降の研究展開により、その同定が可能であろうと予測することができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究は、個体発生過程、特に胎生期の嗅覚神経回路網に焦点をあて、①膜電位感受性色素を用いた神経活動の光学的イメージング法による機能的マッピングと、②カーボシアニン系蛍光色素やrhodamine dextranを用いた形態的マッピングとの比較から、終脳における嗅覚神経回路網の機能発生・構築過程を明らかにすることを第一義の目的としている。令和４年度は、嗅神経の電気刺激により終脳に誘発される光学シグナルのマッピングを行うことにより、嗅覚神経回路網発達の基本データを取得することができた。実験計画は、現在のところほぼ順調に進んでおり、今後の研究遂行の上での問題点は今のところ見当たらず、次年度以降の展開が期待できた。
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| 今後の研究の推進方策 |
様々な発生段階の鶏胚を用いて実験を行ない、基本データを得る。それを元にラット/マウス胎仔で解析を進める。
(1)大脳における嗅神経（N.I）の神経回路網の解析: 「N.I-嗅球-大脳標本」を膜電位感受性色素NK2761で染色し、嗅神経を吸引電極で刺激し、終脳内で応答領域の同定を行う。初期胚脳幹は光透過性がよいので、顕微鏡の焦点面をz軸方向に移動させて"optical sectioning"を行うことにより、光学的三次元機能マッピングを行う。さらに、光学的シグナルの波形解析から、大脳内におけるニューロンの活動電位、興奮性シナプス後電位、抑制性シナプス後電位を分離し、これをさまざまな発生段階の標本を用いて行い、その機能発生・構築過程を調べる。
(2)トレーサーを用いた形態学的観察: (1)で用いた標本をトレーサーで染色して形態学的観察を行い、機能マッピングの結果と比較して、嗅覚回路網を構成する神経核の同定を行う。
(3)疎水性膜電位感受性色素による測定: 疎水性膜電位感受性色素で嗅神経末端や特定の神経核だけを染色し、嗅球や大脳におけるシナプス前応答を独立して記録する。得られた結果を、(1)の結果と比較し、興奮性および抑制性シナプス応答の詳細な分析を試みる。
(4)ラット/マウス胎仔を用いた実験: 以上の項目に関して、ラット/マウス胎仔を用いて同様の実験を行う。得られたデータを鶏胚での結果と比較し、種による違いを明らかにする。
(5)これまでの研究において、鶏胚、ラット/マウス胎仔の脳幹における顔面神経、舌咽神経、迷走神経の機能発生・構築過程の一端を明らかにしてきている。得られているデータを嗅覚系で得られるデータと比較して、様々な脳神経系関連神経回路網の発達過程の一端を明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本研究で用いる光学計測システムは独自に開発した測定装置であるが、この装置の高性能化が研究成功の鍵である。令和4年度は、この測定システムの改良の一部を行い、その性能を確かめた。来年度以降に、令和4年度の結果を吟味して、さらに改良を進めるため研究費の一部を次年度に回した。当初の計画では、国際学会での発表、海外共同研究者の招聘を行う予定でったが、COVID-19の状況から実施できなかった。次年度以降に、当初の計画を進める予定である。
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