| 研究課題/領域番号 |
22K06471
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
笠井 昌俊 京都大学, 医学研究科, 助教 (70625269)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2025-03-31
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| キーワード | 上丘 / 視覚 / 方位選択性 / 化学遺伝学 / 光遺伝学 / カルシウムイメージング / ２光子顕微鏡 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は，動物における，「注意」の生成や，「感覚－運動情報変換」の鍵となる脳の領域である，中脳の上丘を対象に，その視覚情報処理のメカニズムと，生理機能を理解することを目的とする．中でも，上丘と上丘に関連する脳の神経回路に埋め込まれていると考えられる計算モジュールの性質がダイナミックに変化することで，状況に応じて知覚を変化させることが可能になるのではないかという仮説を検証する．
令和４年度は，上丘の神経細胞の視覚応答を，カルシウムイメージングで記録すると同時に，化学遺伝学的に神経活動を操作できる実験系を立ち上げた．細胞種特異的に神経活動を操作するために．抑制性の新毛系細胞に Cre を発現する VGAT-IRES-Cre マウスの上丘に，Cre 依存的に DREADD 受容体を発現するアデノ随伴ウイルス (AAV) ベクター用いて，興奮性・抑制性の DREADD 受容体を発現させた (AAV-hSyn-hM3Dq-mCherry, AAV-hSyn-hM4Di-mCherry)．DREADD 受容体に特異的に結合して作用するアゴニストである DCZ をマウスに投与し，抑制性神経細胞の神経活動が変化することで．カルシウムイメージングで記録する上丘の視覚応答が変化することを現在解析中である．
上丘内の局所神経回路を操作するだけでなく．上丘と密に相互連絡をもつ二傍丘核（PBN) にも DERADD 受容体を発現させる実験を開始した．これらの実験を通して上丘ないの計算機能モジュールがマウスの状態によって空間的・時間的にダイナミックに変化することが明らかにし，上丘の生理機能の理解や，さらには動物の「注意や意識の生成」機構の理解に繋げていく．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
令和４年度は，somaGCaMP 7 を用いたin vivo ２光子カルシウムイメージングと合わせて，興奮性・抑制性の DREADD 受容体である hM3Dq または hM4Di を上丘の神経細胞に同時に発現させ，DCZ を投与することで，化学遺伝学的に視覚応答を変化させる系を立ち上げた．DCZ が上丘で作用させることが可能な濃度を確かめた．また，抑制性の細胞に特異的に DCZ を発現させているため，興奮性の DREADD 受容体である hM3Dq を発現させた場合，DCZ 投与前に比べ，投与後では，カルシウムイメージングしている細胞集団の活動性が全体的に下がること，また反対に抑制性の DREADD受容体である hM4Di を発現させた場合は，全体的に神経活動が上がることを確認できた．現在は，これらのデータをさらに解析し，方向選択性，方位選択性のなどの細胞ごとの視覚応答の性質が変化するかどうかを確かめている．これまで，上丘の方位・方向選択性の解析には，12方向に動く棒状の刺激を使用し，同じ刺激を提示し反応を平均化して解析に使用していたが，試行回数が多く稼げないため，刺激条件ごとの平均を取るよりも．多数の刺激を提示し，全体としてモデル関数にフィットし解析対象となる index を計算する手法を検討している．実際にいくつか実験を行い，10倍以上多くの刺激条件を使用した方が，モデルへのフィッティングの結果が向上し，さらにパラメータの推定にも有効かどうか確かめる予定である．
上丘内の局所回路だけではなく．上丘外の神経回路からの影響も検討を開始している．二傍丘核 (PBN) にも DERADD 受容体を発現させることで，PBN から上丘へのアセチルコリンの入力を変化させる実験を開始した．PBN は非常に小さい神経核のため効率的に遺伝子導入する手法をさらに検討している．
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| 今後の研究の推進方策 |
DREADD による神経活動操作の結果起こる視覚応答特性の解析を進めていく．また，現在使用している AAV 2/1-hSyn-somaGCaMP7 と AAV9-hSyn-READD-mCherry の２種類のウイルスを用いた場合，感染する領域の差が大きくなってしまう場合が多い．そのため，注入する AAV ベクターの濃度をさらに検討し，２つのウイルスが同程度に広がり感染領域に差が出ないようにすることを検討している．また逆に DREADD の効果範囲を広げるために，観察領域のみに GCaMP を発現させ DREADD 受容体は，より広い範囲にウイルス注入を行うことも検討している．
以前の研究から，両側の PBN から，片側の上丘に入力があることがわかっている．そこで現在は同側の PBN をターゲットに AAV を試みているが，効率的に注入することが可能になれば，反対側，さらには両側の PBN を同時に抑制することも検討していきた．
さらに，大脳皮質からの入力の影響も検討する．上丘に逆行性に Cre を発現させ，Cre 依存的に V1 に DREADD 受容体を発現させることを検討している．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
予算は順調に執行している．基金のため消耗品等で使い切ることはせず，年度以降の物品費で使用予定．
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| 備考 |
視覚刺激提示・記録・解析システム
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