研究課題
Gタンパク質は細胞外のシグナルを細胞内に伝える仲介因子として知られている。Gs、Gi、GqおよびG12の4つのグループに分けられる。Gsはアデニル酸シクラーゼの活性化、Giはアデニル酸シクラーゼの抑制、GqはホスホリパーゼCの活性化G12ファミリーはRhoAの活性化を、それぞれ引き起こすと考えられている。G12ファミリーにはG12とG13が含まれている。いずれもRhoAを活性化するものの、in vivoではお互いの機能を相補しないため、RhoA以外のシグナル経路も活性化していると考えられている。すなわちG12とG13はRhoA以外の独自のシグナル経路を活性化していると想定されている。本研究では、G12とG13独自のシグナル経路を、リン酸化プロテオミクスの手法を用いて明らかにすることを目的としている。G12とG13を選択的に活性化するためにクロザピン-N-オキシド(CNO)のみをアゴニストとするデザイナー受容体を用いる。G12選択的デザイナー受容体は作製していることから、G12選択的シグナルの解析を開始した。HEK293A細胞にG12選択的デザイナー受容体を発現させ、CNOで刺激し反応を停止させた後、リン酸化されたペプチドを質量分析にて解析した。G12選択的デザイナー受容体はG12以外にもGqを活性化することから、Gqシグナルの関与はGq阻害剤(YM-254890)を添加することで除く必要がある。また、G12およびG13はRhoAを活性化することから、RhoAキナーゼが共通に活性化されていると考えられている。したがって、RhoAキナーゼ以外でリン酸化されたシグナリング分子を同定することで、G12およびG13選択的シグナリングを明らかにできると考えている。
2: おおむね順調に進展している
G12選択的なシグナリング経路としてPKGやPKAを活性化する経路を示す結果を得ている。これまで、G12ファミリーの下流で活性化されるシグナリングについては、RhoA以外の経路は解析されてこなかったため、PKGやPKAの活性化は新たな経路として提唱できると考えている。G12ファミリーは細胞増殖(がん化を含む)にも関わっていることから、新たなシグナリング経路はがん化のメカニズム解明に貢献できると考えているため、おおむね順調に進展していると評価した。
今後の実験を箇条書きにした。(1)Gq阻害剤の添加でのリン酸化プロテオミクスを実施する。プロテオミクスは些細なことで結果が大きく振れるため、数回の実験を行い、再現性を確認する。(2)G12ファミリーが影響を与えるRhoA以外のシグナリング分子として、ホスファターゼ5とインテグリンが報告されている。したがって、これらシグナリング分子の阻害剤を添加し、同定したシグナリング分子(PKGやPKA)のリン酸化活性がどのように影響を受けるか検討する。(3)今回同定したシグナリング分子はプロテインキナーゼAプロテインキナーゼGであり、これまでG12の下流で解析されてこなかった。さらに、どのようにG12からプロテインキナーゼへのシグナルが伝達されているのかも未知である。サイクリックヌクレオチド依存性のタンパク質リン酸化酵素(PKGやPKA)がサイクリックヌクレオチドを介さずに活性化されているならば、新しいシグナリング経路として提唱できる。(4)重要な点はHEK293A細胞を用いたin vitroの結果がin vivoでも活性化されていることを示す必要がある。今回同定したG12選択的シグナリングがin vivoでも活性化されていることを示すため、ゼブラフィッシュに発現させ、RNAiを用いたノックダウンや阻害剤を用いた実験を行い確認できないかと考えている。
(理由)予定していた阻害剤を用いたリン酸化プロテオミクス解析が、処理するサンプル数が多くなったため次年度に実施することになり、次年度使用額が生じた。(使用計画)阻害剤を用いたリン酸化プロテオミクス解析に要する費用を物品費と合わせて使用する予定である。
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すべて 国際共同研究 (2件) 雑誌論文 (5件) (うち国際共著 3件、 査読あり 5件、 オープンアクセス 4件)
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