| 研究課題/領域番号 |
22K06746
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| 研究機関 | 東北医科薬科大学 |
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研究代表者 |
蓬田 伸 東北医科薬科大学, 薬学部, 准教授 (80230845)
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| 研究期間 (年度) |
2022-04-01 – 2026-03-31
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| キーワード | K562 / Doxorubicin耐性 / P-タンパク質 / 排出機能 / SecinH3 / ARF6 |
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| 研究実績の概要 |
初めにSecinH3のP-gpの排出機能に対する用量依存性について検討したところ、SecinH3は2.7、5.4、10、15、30 μMと容量依存的に蛍光色素の排出を抑制し、IC50は約10.96 μMであった。次に、Doxorubicin耐性K562細胞（ADR）においてCytohesin2、GEP100、ARF6、ARF1の発現に違いがあるかをWestern blottingで検討した。その結果、ADRにおいてGEP100及びARF6のタンパク質の発現は増加しおり、GEP100は細胞質画分において、ARF6は膜・オルガネラ画分で顕著に増加していた。一方、Cytohesin2やARF1はADRにおいて、タンパク質の発現が低下しており、Cytohesin2は膜・オルガネラ画分において顕著に低下していた。しかしながら、これらタンパク質の発現にSecinH3は影響を与えなかった。
次に、SecinH3がP-gpに直接作用し排出機能を抑制していると考え、P-gpを高発現させた昆虫培養細胞株Sf9の細胞膜vesicleを用いて蛍光色素の排出に対する影響を検討した。その結果、既知の阻害剤では100 μM（75.9％）、2 mM（38.9％）と排出を抑制したが、SecinH3は5（97.8％）、10（91.3％）、15（110.8％）、30（103.2％）μMのいずれの濃度においても蛍光色素の排出を抑制しなかった。このことから、SecinH3のP-gpへの直接作用については可能性が低いこと示唆された。
P-gpの機能や発現にはERMタンパク質の関与が報告されていることから、網羅的解析で差が見られたmoesinとezrinについてmRNAの発現をリアルタイムPCRで検討した。その結果、ezrinではその変化は確認できなかったが、moesinはADRにおいて2倍以上の差が見られた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
IC50により、GEFに予想を付けようとしたがこれまでの系と違うことからCytohesin2とGEP100に絞ってタンパク質の発現を検討した。また、蛍光顕微鏡による局在性の確認ではなく、細胞分画を行いWestern blottingで行ったことにより、膜・オルガネラ画分でARF6の発現が増加していた。このことから、ARF6の活性化がSecinH3で抑制されていないか、膜・オルガネラ画分を用いて検討することも必要かもしれないと考えている。さらに、これまで用いてきた蛍光色素が発売中止となったことにより、今後、他の蛍光色素で検討する必要性が出てきた。
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| 今後の研究の推進方策 |
ERMタンパク質のezrin、radixin、moesinは、相同性が高いタンパク質群の総称で、アクチン細胞骨格と原形質膜とをクロスリンクする働きがあり、細胞の形態維持や構造変化に関与する。また、通常は細胞内で非活性型の構造を取っており、P-gpの細胞膜上の発現には関与していないが、刺激が入ると活性化され、P-gpを安定化する働きがある。この活性化には、ホスファチジルイノシトール二リン酸（PIP2）や低分子量Gタンパク質の関与が報告されている。このことから、DNAマイクロアレイ、リアルタイムPCRやプロテオミクス解析により、ERMタンパク質のなかでmoesinの遺伝子及びタンパク質が上昇していることを確認している。そこで、moesinを含めたERMタンパク質のリン酸化に対するSecinH3の効果についてリン酸化抗体を用いて検討する。さらに、GEP100やERMタンパク質のsiRNAを作成し、Amaxa Cell Line Nucleofector Kit Vを用いてADRに導入し、P-gpの発現や機能についてGEP100及びERMタンパク質の関与を検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当該年度は、学務などにより思うように実験が進まなかったことから、当初予定していた学会への参加を見送った。また、購入予定の抗体、SecinH3や蛍光色素などは、事前に購入していたものを使用したことにより使用額が少なくなった。次年度については、学会参加等を積極的にできるように計画的に進めたい。
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